| Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen ohne Print on Demand (4MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-274107
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.27410
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 24 Januar 2014 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Ralf Wagner |
| Tag der Prüfung: | 22 Januar 2013 |
| Institutionen: | Medizin > Lehrstuhl für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene |
| Stichwörter / Keywords: | CpG, epigenetic control, transgene expression, epigenetische Kontrolle, Transgen-Expression, gene therapy, Gentherapie |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 27410 |
Zusammenfassung (Englisch)
The improvement of gene therapy applications and efficient production of recombinant therapeutics in mammalian cells is a growing field of interest in medical and pharmaceutical research. Plasmid-DNA (pDNA)-based vector systems offer an innovative gene transfer strategy due to their high stability, cost efficient production and their excellent safety profile. Despite these advantages, the ...
Zusammenfassung (Englisch)
The improvement of gene therapy applications and efficient production of recombinant therapeutics in mammalian cells is a growing field of interest in medical and pharmaceutical research. Plasmid-DNA (pDNA)-based vector systems offer an innovative gene transfer strategy due to their high stability, cost efficient production and their excellent safety profile. Despite these advantages, the application of pDNA-vectors is limited compared to viral-vector-based gene transfer regarding transgene expression rates. This requires new strategies to optimize pDNA-based gene expression systems. The directed utilization of transcription regulating mechanisms in the target cell is a major strategy towards this aim. In this regard, CpG dinucleotides in transgenes have proven to serve as crucial expression-modulating elements.
Previous studies have demonstrated a strong correlation between the presence of CpG dinucleotides in transgenes and the level of gene expression by means of the reporter genes coding for the murine macrophage inflammatory protein 1 alpha (MIP-1α) and humanized green fluorescent protein (GFP). The DNA sequence of mip-1α and gfp was modified by using alternative codons. Based on the mip-1α wild type sequence, a codon optimized, CpG-depleted and CpG-enriched mip-1α gene variant were generated. Additionally, the CpG-rich gfp, optimized for human codon usage, and the CpG-depleted gfp, provided the basis for gene expression analyses. Decreased gene expression was observed as a result of intragenic CpG depletion, whereas the enrichment of intragenic CpG dinucleotides led to a dramatic increase of gene expression. No evidence for CpG-based posttranscriptional regulation mechanisms could be found. Instead, intragenic CpG dinucleotides clearly correlated with enhanced de novo synthesized mRNA.
This study aimed to shed light on the CpG-induced mechanisms responsible for expression efficiency variations in gfp and mip-1α. The relative expression profile of CpG modified gfp transgenes in CHO Flp-In cells could be maintained over at least a year under antibiotic selection pressure. Withdrawal of selective conditions resulted in gradual decrease in gfp expression which was shown to be a consequence of both transgene loss and DNA methylation. While a high intragenic CpG frequency promoted DNA methylation rates of the mediating promoter, intragenic CpG depletion led to accelerated transgene loss. Moreover, gene expression decline upon selection pressure withdrawal correlated with a higher chromatin density in both gfp variants. Notably, chromatin compaction also correlated with intragenic CpG depletion in gfp and mip-1α, stably expressed in Flp-In CHO and HEK 293 cells under selection pressure. CpG variations in gfp were furthermore shown to influence nucleosome positions in vitro. The detection of increased actively transcribing RNAPII at the gene end of CpG maximized mip-1α transgenes in stably transfected HEK 293 Flp-In cells indicated enhanced elongation rates resulting from CpG enrichment. Expression analyses of gfp chimera revealed that not only the CpG frequency, but rather the proximity of intragenic CpG dinucleotides to the transcription start site (TSS) is beneficial for transgene efficiency.
To test the effects of intragenic CpG dinucleotides on transgene expression efficiency in a gene therapy-relevant cell system, murine embryonic pluripotent stem cells of the line P19 were stably transduced with lentiviral vectors (LV) containing the respective gfp variants under different promoters. The promoter of the cytomegalovirus (CMV) revealed a high disposition for gene silencing in this expression system. Compared to the CMV promoter, gfp transcription by the elongation factor 1 alpha (EF-1α) promoter resulted in delayed, yet significant transgene silencing in P19 cells. In contrast, the bidirectional, dual divergently transcribed A2UCOE promoter prevented transgene silencing via its chromatin opening abilities completely. With regard to CpG frequency, the LV-P19 expression system could also benefit from the presence of intragenic CpG dinucleotides under certain conditions, in spite its high gene silencing potential. EF 1α promoter controlled expression of the CpG-maximized gfp variant was clearly increased over the CpG-depleted gfp in P19 cells. CMV promoter-mediated gfp expression revealed slightly delayed gene silencing in CpG-rich compared to CpG depleted gfp. In contrast, A2UCOE-mediated transcription was not affected by intragenic CpG dinucleotides. It is assumed that A2UCOE can overcome chromatin compaction arising from intragenic CpG depletion due to its chromatin opening property.
The sum of data could show that TSS-adjacent intragenic CpG dinucleotides in gfp and mip-1α transgenes positively influence transcription efficiency. The results gained in this work imply that this effect results from delocalization and destabilization of the +1 nucleosome, whereas intragenic CpG depletion leads to a higher level of chromatin density. These chromatin changes are assumed to result from a complex epigenetic regulation network triggered by intragenic CpG changes. The exact mechanism of this phenomenon remains to be elucidated.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Die effiziente Produktion rekombinanter Therapeutika in Säugerzellen und Verbesserung gentherapeutischer Verfahren sind bedeutende und expandierende Felder in der medizinischen und pharmazeutischen Forschung. Plasmid-DNA (pDNA)-basierte Vektorsysteme stellen aufgrund ihrer Stabilität, der kostengünstigen Produktion sowie ihres hervorragenden Sicherheitsprofils ein innovatives Gentransfer-System ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Die effiziente Produktion rekombinanter Therapeutika in Säugerzellen und Verbesserung gentherapeutischer Verfahren sind bedeutende und expandierende Felder in der medizinischen und pharmazeutischen Forschung. Plasmid-DNA (pDNA)-basierte Vektorsysteme stellen aufgrund ihrer Stabilität, der kostengünstigen Produktion sowie ihres hervorragenden Sicherheitsprofils ein innovatives Gentransfer-System dar. Trotz dieser Vorteile ist der Einsatz von pDNA-Vektoren angesichts begrenzter Transgen Expressionsraten gegenüber Virus-basierten Verfahren limitiert. Dies erfordert neue Strategien zur Optimierung von pDNA-basierten Genexpressionssystemen, wie beispielsweise durch die gezielte Nutzung transkriptionsregulierender Mechanismen der Zielzelle. CpG Dinukleotide in Transgenen haben sich diesbezüglich als entscheidende Expressions-modulierende Elemente erwiesen.
Anhand der Reportergene codierend für das murine Makrophagen inflammatorische Protein 1 alpha (MIP-1α) und das humanisierte grün fluoreszierende Protein (GFP) konnte bereits in früheren Studien ein proportionaler Zusammenhang zwischen CpG Dinukleotiden im offenen Leserahmen und einem erhöhten Genexpressionslevel gezeigt werden. Dazu wurden die Nukleinsäure-Sequenzen der mip-1α und gfp Gene unter Verwendung alternativer Codons modifiziert. Ausgehend vom mip-1α Wildtyp wurde ein Codon-optimiertes Gen, sowie eine CpG-freie und eine CpG-maximierte Genvariante hergestellt. Weiterhin dienten das für humane Zellen Codon-optimierte gfp Gen und darauf basierend ein CpG-freies gfp Gen als Ausgangskonstrukte für Genexpressionsanalysen. Es konnte gezeigt werden, dass intragenische CpG Dinukleotide einen positiven Einfluss auf die Genexpression in Säugerzellen ausüben, während eine CpG Depletion zu starken Expressionsverlusten führt. Während keine Hinweise auf veränderte CpG-basierte posttranskriptionelle Regulations-mechanismen zu finden waren, konnte eine deutliche Korrelation zwischen intragenischen CpG Dinukleotiden und gesteigerter de novo synthetisierter mRNA hergestellt werden.
In der vorliegenden Arbeit sollten die durch differenziellen intragenischen CpG Gehalt hervorgerufenen Regulationsmechanismen von gfp und mip-1α aufgeklärt werden. Das relative Expressionsprofil der CpG-modifizierten gfp Transgene in CHO Flp-In Zellen konnte über den Zeitraum von mindestens einem Jahr durch antibiotischen Selektionsdruck konstant gehalten werden. Die Abwesenheit selektiver Bedingungen resultierte dagegen in sukzessiven Expressionseinbußen, welche sowohl auf Transgenverluste als auch DNA-Methylierung zurückzuführen waren. Während eine hohe intragenische CpG Frequenz zu gesteigerten Methylierungsraten des Transgen-kontrollierenden Promoters führte, hatte eine intragenische CpG Depletion einen beschleunigten Transgenverlust zur Folge. Der Genexpressions-Rückgang nach Selektionsrestriktion korrelierte weiterhin bei allen gfp Varianten mit einer höheren Chromatin-Dichte. Interessanterweise ging auch die CpG Depletion der in Flp-In CHO und HEK 293 stabil und unter Selektionsdruck integrierten gfp und mip-1α Transgenvarianten mit einer Chromatin-Verdichtung einher. Darüber hinaus bewirkte der variable CpG-Gehalt in gfp eine veränderte in vitro Positionierung von Nukleosomen. Die Detektion vermehrt aktiv transkribierender RNA Polymerasen II am Gen Ende CpG-maximierter mip-1α Transgene in stabil transfizierten HEK 293 Flp-In Zellen ließ auf erhöhte Elongationsraten als Folge von CpG Maximierung schließen. Expressionsanalysen von gfp Chimären konnten zeigen, dass sich nicht nur die CpG Frequenz, sondern vielmehr die räumliche Nähe intragenischer CpG Dinukleotide zum Transkriptionsstart (TSS) positiv auf die Expressionseffizienz auswirken.
Um die Effekte intragenischer CpG Dinukleotide auf die Transgenexpression in einem Gentherapie-relevanten Zellsystem zu testen, wurden murine, embryonale pluripotente Stammzellen der Linie P19 mittels lentiviraler Vektoren stabil mit den gfp CpG Varianten unter verschiedenen Promotoren transduziert. Der Promotor des Cytomegalovirus (CMV) wies in diesem Expressionssystem eine erhöhte Disposition bezüglich gene silencing auf. Im Vergleich zum CMV Promotor führte der Promotor des humanen Elongationsfaktors 1 alpha (EF-1α) zu verzögerten, dennoch deutlichen, Expressionsverlusten. Im Gegensatz dazu verhinderte der bidirektionale, divergent transkribierte Promoter A2UCOE aufgrund seiner ubiquitären Chromatin-öffnenden Eigenschaften eine Transgen-Stilllegung komplett. In Bezug auf den intragenischen CpG Gehalt konnte auch dieses Expressionssystem trotz hohem gene silencing Potentials unter bestimmten Bedingungen von der Anwesenheit intragenischer CpG Dinukleotide profitieren. So wies das CpG angereicherte gfp, exprimiert durch den EF-1α Promotor, auch in P19 Zellen eine deutlich erhöhte Expressionseffizienz auf. Weiterhin konnte die Gen-Stilllegung des CMV Promotor-kontrollierten gfp durch intragenische CpG Dinukleotide leicht verzögert werden. Die durch den A2UCOE Promotor vermittelte Transkription hingegen wurde durch intragenische CpG Dinukleotide in gfp nicht beeinflusst. Es wird vermutet, dass die Chromatin öffnende Funktion des A2UCOE Elements eine Chromatin-Kompaktierung als Folge der CpG Depletion verhindern kann. Mit dieser Eigenschaft scheint A2UCOE die Nachteile der CpG-Depletierung durch Chromatin Verdichtung aufheben zu können.
Insgesamt konnten die anhand der Transgene gfp und mip-1α gewonnenen Daten zeigen, dass sich intragenische CpG Dinukleotide in TSS-Nähe positiv auf die Transkriptionseffizienz auswirken. Die durchgeführten Analysen deuten darauf hin dass dieser Effekt auf die Delokalisierung und Destabilisierung des +1 Nukleosoms durch TSS proximale intragenische CpG Dinukleotide zurück geht, während eine intragenische CpG Depletion eine Chromatin Kondensation zur Folge hat. Diese Veränderungen der Chromatinstruktur werden als Ergebnis epigenetischer Regulationsmechanismen postuliert, die durch die An-, beziehungsweise Abwesenheit intragenischer CpG Dinukleotide hervorgerufen werden. Die genauen Mechanismen dieses Phänomens sind weiterhin nicht vollständig geklärt.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 03:18
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