The role of BMP and TGFß signalling in the terminal differentiation in the in vitro chondrogenesis of mesenchymal stem cells

URN zum Zitieren dieses Dokuments:: urn:nbn:de:bvb:355-epub-289408
DOI zum Zitieren dieses Dokuments:: 10.5283/epub.28940

Karl, Alexandra

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Veröffentlichungsdatum dieses Volltextes: 18 Okt 2013 11:55

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Dokumentenart:	Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation)
Open Access Art:	Primärpublikation
Datum:	18 Oktober 2013
Begutachter (Erstgutachter):	Prof. Dr. Peter Angele
Tag der Prüfung:	15 Oktober 2013
Institutionen:	Medizin > Lehrstuhl für Unfallchirurgie
Stichwörter / Keywords:	Mesenchymal stem cells, Chondrogenesis, tissue engineering, cartilage
Dewey-Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik > 500 Naturwissenschaften 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin
Status:	Veröffentlicht
Begutachtet:	Ja, diese Version wurde begutachtet
An der Universität Regensburg entstanden:	Ja
Dokumenten-ID:	28940

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Zusammenfassung (Englisch)

Zusammenfassung (Englisch)

Articular cartilage has a poor intrinsic repair capacity after injury and cartilage lesions may lead to further degeneration and osteoarthritis. Mesenchymal stem cells (MSCs) are a promising cell source for tissue engineering approaches to repair articular cartilage lesions. During in vitro chondrogenesis, MSCs express articular cartilage markers like collagen II and aggrecan. However, chondrogenic differentiating MSCs also express markers of hypertrophic chondrocytes such as collagen type X and alkaline phosphatise (ALP). Hypertrophy is a stage in endochondral bone development, e.g. in growth plate chondrocytes and ultimately ends in chondrocyte apoptosis and ossification. The similarity of MSC chondrogenesis and endochondral ossification raises concern for a tissue engineering application of MSCs for articular cartilage repair and suggests that similar mechanisms are involved in the regulation of hypertrophy in both biological processes. In growth plate chondrocytes, BMP signalling promotes and TGFß signalling inhibits hypertrophy. The goal of this thesis is to investigate the involvement of these pathways in the regulation of MSC hypertrophy in order to discover possible approaches for the modulation of this phenomenon.
Human MSCs were differentiated chondrogenically in pellet culture in chondrogenic medium containing TGFß and dexamathasone. In an in vitro hypertrophy model, the hypertrophic phenotype was enhanced by withdrawal of TGFß and dexamethasone and addition of triiodothyronine (T3). Differential gene expression analysis for ligands, receptors and modulators of BMP and TGFß signalling and confirmation of the results on protein level was carried out. The activity of the respective intracellular signalling pathways was assessed. Furthermore, functional experiments using agonists and antagonists of BMP and TGFß signalling were included.
The enhancement of the hypertrophic phenotype by the pro-hypertrophic medium conditions was clearly shown by increased cells size, collagen type X deposition and ALP activity. Differential gene expression analysis revealed up-regulation of BMP4, BMP receptor 1B and the BMP signalling associated transcription factor Runx2 upon induction of hypertrophy. Addition of BMP4 to the medium further enhanced hypertrophy, confirming the key role of BMP4 in the regulation of MSC hypertrophy in our model. In addition, it was shown that the induced hypertrophy could be blocked by the BMP antagonists noggin and dorsomorphin. On the other hand, TGFß receptor expression, the expression of the TGFß signalling associated transcription factor Sox9 and TGFß signalling activity are reduced under pro-hypertrophic conditions.
In conclusion, the results show that increased BMP signalling and reduced TGFß signalling are both involved in the enhancement of the hypertrophic phenotype. These pathways are possible targets for the modulation of the amount of hypertrophy in MSC based cartilage tissue engineering applications.

Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)

Artikulärer Knorpel weist eine schlechte Regenerationsfähigkeit nach Verletzungen auf und Knorpelverletzungen können zu weiteren Degenerationen und Osteoarthritis führen. Mesenchymale Stammzellen (MSCs) sind eine vielversprechende Zellquelle für die Entwicklung von Tissue Engineering Produkten zur Reparatur von lokalisierten Knorpelschäden. In den üblicherweise verwendeten in vitro Chondrogenese Modellen differenzieren MSCs chondrogen und exprimieren typische chondrogene Marker wie Kollagen II und Aggrecan. Chondrogen differenzierende MSCs exprimieren jedoch auch Hypertrophiemarker wie Kollagen X und Alkalische Phosphatase (ALP). Hypertrophie ist ein Stadium während der endochondralen Knochenentwicklung, insbesondere in Wachstumsfugen-chondrocyten und führt unweigerlich zur Apoptose der Chondrozyten und zur Ossifikation. Die Ähnlichkeit von MSC Chodrogenese und endochondraler Ossifikation macht den Einsatz von MSCs für die Entwicklung von Tissue Engineering Produkten zur Reparatur von Knorpelschäden bedenklich und deutet darauf hin dass ähnliche Mechanismen in der Regulation der Hypertrophie in beiden Prozessen beteiligt sind. Aus der Wachstumsfuge ist bekannt, dass verschiedene Wachstumsfaktorsysteme an der Regulation der hypertrophen Differenzierung beteiligt sind, darunter BMP und TGFß Signalling. BMP Signalling fördert die terminale Differenzierung und TGFß Signalling hemmt die Hypertrophie. Das Ziel dieser Arbeit lag darin, die Regulation der MSC Hypertrophie besser zu verstehen um Wege zu finden die Hypertrophie von MSCs zu hemmen. Insbesondere der Einfluss von BMP und TGFß Signalling auf die Hypertrophieentwicklung von MSCs wurde untersucht.
Humane MSCs wurden in einem Pellet Kultur System in chondrogenem Medium das TGFß und Dexamethazon enthält chondrogen differenziert. In einem in vitro Hypertrophie Modell wurde der hypertrophe Phänotyp durch den Entzug von TGFß und Dexamethazon und eine Zugabe von dem Schilddrüsenhormon T3 erhöht. Eine differentielle Genexpressionsanalyse von Liganden, Rezeptoren und Modulatoren von BMP und TGFß Signalling wurde vergleichend zwischen chondrogenen und hypertrophen Bedingungen durchgeführt. Die Aktivität der jeweiligen Signalwege wurde analysiert und funktionelle Experimente mit BMP und TGFß Agonisten und Antagonisten wurden durchgeführt.
Die Verstärkung der Hypertrophie unter pro-hypertrophen Bedingungen wurde gezeigt durch ein stark erhöhtes Zellvolumen, erhöhte Kollagen X Expression und gesteigerter ALP Aktivität. Die differentielle Genexpressionsanalyse zeigt, dass unter pro-hypertrophen Bedingungen BMP4, BMPR1B und der BMP Signalling assoziierte Transkriptionsfaktor Runx2 signifikant hochreguliert sind. Darüber hinaus führt eine Zugabe von rekombinantem BMP4 Protein zum Zellkulturmedium zu einer Verstärkung der Hypertrophie, was eine Schlüsselrolle von BMP4 in der Regulation der MSC Hypertrophie in unserem Modell untermauert. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die induzierte Hypertrophie durch die BMP Antagonisten Noggin und Dorsomorphin gehemmt werden kann.
Auf der anderen Seite ist sowohl die Expression der TGFß Rezeptoren und des TGFß Signalling assoziierte Transkriptionsfaktor Sox9 als auch die Aktivität des TGFß Signalweges unter hypertrophen Bedingungen erniedrigt.
Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse dass verstärktes BMP Signalling und reduziertes TGFß Signalling beide zu der Erhöhung des hypertrophen Phänotyps beitragen. Diese Signalwege sind mögliche Ansatzpunkte für die Modulation der Hypertrophie in MSC basierenden Knorpelersatzprodukten.

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