Silencing von Transgenen und Transposons durch DNA-Methylierung bei Volvox

Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Open Access Type:	Primary Publication
Date:	18 May 2004
Referee:	Rüdiger (Prof. Dr.) Schmitt
Date of exam:	8 May 2003
Institutions:	Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie
Keywords:	Volvox carteri , Transformation , Methylcytosin <5-> , Transposon , DNS-Methyltransferase , Transgen Silencing , Epigenetik , DNS-Methylierung , Volvox carteri , transgene silencing , DNA methylation , transposon , DNA methyltransferase
Dewey Decimal Classification:	500 Science > 570 Life sciences
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	10198

Abstract (German)

Die vielzellige Kugelalge Volvox carteri ist mit einer vollständigen Arbeitsteilung zwischen nur zwei Zelltypen - somatischen und reproduktiven - ein idealer Modellorganismus für die Analyse grundlegender Mechanismen von Entwicklung und Zelldifferenzierung. Jedoch wird die Untersuchung von V. carteri oft durch die nicht kontrollierbare Stillegung von eingeschleusten Transgenen durch ...

Abstract (German)

Die vielzellige Kugelalge Volvox carteri ist mit einer vollständigen Arbeitsteilung zwischen nur zwei Zelltypen - somatischen und reproduktiven - ein idealer Modellorganismus für die Analyse grundlegender Mechanismen von Entwicklung und Zelldifferenzierung. Jedoch wird die Untersuchung von V. carteri oft durch die nicht kontrollierbare Stillegung von eingeschleusten Transgenen durch DNA-Methylierung erschwert. Ziel dieser Arbeit war es daher, die Art, den Vorgang und die Funktion der DNA-Methylierung bei Volvox aufzuklären, um einerseits Methodisches zu verbessern, andererseits und vor allem aber den Stellenwert dieses �epigenetischen Phänomens� bei Grünalgen besser zu verstehen.
Mit dünnschichtchromatographischen Methoden wurde der Gehalt an modifizierten Basen in verschiedenen DNA-Präparationen von V. carteri bestimmt. Nukleäre DNA enthält demnach 1,1 % 5-Methylcytosin (5mC) und 0,3 % N6-Methyladenin (6mA). Das Gen einer DNA-Cytosin-Methyltransferase, met1, wurde kloniert und fast vollständig sequenziert. Vergleiche der abgeleiteten Proteinsequenz mit Sequenzen bekannter Methyltransferasen identifizierten Met1 als CpG-spezifische Erhaltungs-Methyltransferase.
Das silencing eines funktionell intakten C-ars-Transgens bei Volvox korreliert mit CpG-Methylierung, die sich über das gesamte Transgen erstreckt. In vitro CpG-methylierte Gene werden nach Transformation von V. carteri nicht exprimiert und bleiben auch nach vielen Generationszyklen methyliert. Die Cytosin-Methylierung ist bei V. carteri - wie bei Tieren - auf CpG-Dinukleotide beschränkt, eine Methylierung von CpNpG- oder asymmetrischen Sequenzmotiven wie bei vielen Pflanzen wurde nicht beobachtet.
Als eines der natürlichen Ziele der Cytosin-Methylierung bei V. carteri wurden Transposons identifiziert: Das nicht-mobile Retrotransposon Osser ist zu 20-30 % CpG-methyliert. Auffallend waren häufige C nach T � Austausche im CpG-Kontext, die auf Desaminierung von 5mC zurückgeführt wurden. Das führt zur Annahme, dass die Inaktivität von Retrotransposons wie Osser primär aus CpG-Methylierungen resultiert; die Integrität dieser Elemente geht dann sekundär durch Mutationen verloren.

Translation of the abstract (English)

The multicellular green algae Volvox carteri with its complete division of labour between two cell types � somatic and reproductive cells � is a model ideally suited for studying basic mechanisms of development and cell differentiation. However, the uncontrollable silencing of transgenes by DNA methylation frequently impedes the analysis of V. carteri. Therefore the aim of this work was to ...

Translation of the abstract (English)

The multicellular green algae Volvox carteri with its complete division of labour between two cell types � somatic and reproductive cells � is a model ideally suited for studying basic mechanisms of development and cell differentiation. However, the uncontrollable silencing of transgenes by DNA methylation frequently impedes the analysis of V. carteri. Therefore the aim of this work was to eludicate the principles of DNA methylation in Volvox to improve methods, but mainly to get a better understanding how this epigenetic phenomenon works in green algae.
The content of modified bases in different DNA preparations of V. carteri was determined by thin layer chromatography. Nuclear DNA contains 1.1 % of 5-methylcytosine (5mC) and 0.3 % of N6-methyladenine (6mA). The gene of a DNA-cytosine-methyltransferase, met1, was cloned and sequenced almost completely. Comparisons of the derived protein sequence with sequences of known methyltransferases identified Met1 as a CpG-specific maintenance methyltransferase.
The silencing of a functionally intact C-ars transgene in Volvox correlates with CpG methylation which spreads all over the gene. In vitro CpG methylated genes are not expressed after transformation of V. carteri and stay methylated for many generations. Cytosine methylation in V. carteri is � like in animals � restricted to CpG dinucleotides, there is no methylation of CpNpG or asymmetric motifs like in many plants.
One of the natural targets of cytosine methylation in V. carteri are transposons: 20-30 % of the CpG dinucleotides of the immobile retrotransposon Osser are methylated. Many C-to-T mutations were observed within Osser in the CpG context, which probably result from deamination of 5mC. This leads to the hypothesis that the inactivity of retrotransposons like Osser primarily results from CpG methylation; the integrity of those elements gets lost secondarily by mutations.

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