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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-3983
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.10253
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 6 March 2005 |
| Referee: | Rüdiger (Prof. Dr.) Schmitt |
| Date of exam: | 4 March 2004 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie |
| Keywords: | Bodenbakterien , Motilität , Molekularer Motor , Elektrostatische Wechselwirkung , , soil bacteria , motility , molecular motor , electrostatic interaction |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 10253 |
Abstract (German)
Die Flagellen von Sinorhizobium meliloti rotieren im Gegensatz zu Escherichia coli-Geißeln nur im Uhrzeigersinn. Richtungsänderungen der schwimmenden Zelle werden durch Variation der Rotationsgeschwindigkeit einzelner Flagellen und eine daraus resultierende Auflösung des geordneten Geißelbündels erreicht. Der Flagellenmotor von S.meliloti enthält konservierte Komponenten, wie MotA, MotB, FliM, ...
Abstract (German)
Die Flagellen von Sinorhizobium meliloti rotieren im Gegensatz zu Escherichia coli-Geißeln nur im Uhrzeigersinn. Richtungsänderungen der schwimmenden Zelle werden durch Variation der Rotationsgeschwindigkeit einzelner Flagellen und eine daraus resultierende Auflösung des geordneten Geißelbündels erreicht.
Der Flagellenmotor von S.meliloti enthält konservierte Komponenten, wie MotA, MotB, FliM, FliN und FliG. Darüber hinaus wurden neue Mot-Proteine, MotC, MotD und MotE identifiziert, die essentielle Spezifika des S.meliloti-Flagellenmotors (und verwandter) darstellen (Sourjik et al., 1998). Von diesen wurde hier das MotC-Protein analysiert.
Es stellte sich aber heraus, daß die Verhältnisse bestimmter geladener AS-Reste an der Kontaktfläche von Protonenkanal (MotA) und Rotor (FliG) für das Rotationsmuster und folglich die Bewegung schwimmender S.meliloti-Zellen entscheidende Bedeutung haben. Deshalb wurde hier auf die genetische, protein-biochemische und funktionelle Untersuchung dieser Reste und ihre Wirkung besonderer Wert gelegt.
Die wichtigsten Ergebnisse und Schlußfolgerungen dieser Arbeiten lassen sich wie folgt zusammenfassen:
(1) Die unbekannten motA, motC und fliG-Sequenzen von Rhizobium lupini H13-3 wurden erschlossen, mit den bekannten Orthologen von S.meliloti, Agrobacterium tumefaciens und Mesorhizobium loti verglichen und auf diese Weise konservierte Domänen definiert.
(2) Die periplasmatische MotC-Komponente stellt durch Bindung an das MotB-(Kanal-) Protein die Funktionsfähigkeit des energetisierenden Protonenkanals sicher. MotC dient möglicherweise als �Protonenfalle� oder �pmf-Sensor�, weil S.meliloti-Zellen bei höheren pH-Werten (bis pH 9,5) noch schwimmen als E.coli-Zellen (bis pH 9,0). Bereits früher identifizierte, im zentralen Bereich von MotC durch Deletionen hervorgerufene Funktionsdefekte wurden hier weitgehend auf die Instabilität der Mutantenproteine zurückgeführt. Deshalb müssen weitere Untersuchungen mit (stabilen) Substitutionen einzelner Reste im MotC-Protein durchgeführt werden.
(3) Durch gezielte Mutagenese wurden 68 Einzel-, Doppel und Dreifachaustausche der konservierten geladenen Reste Arg90 und Glu98 (MotA) bzw. Arg294, Glu300, Ser301 und Asp302 (FliG) generiert und die Schwärm- und Schwimmfähigkeit der resultierenden Mutanten bestimmt. Aus den Resultaten lassen sich drei Mutantenklassen ableiten:
a) Reste, die für die Flagellenrotation essentiell sind, weil ihr Ausfall die Aufhebung oder eine deutliche Reduktion der Rotationsgeschwindigkeit hervorruft. In dieser Kategorie sind Glu98 und Arg294 absolut notwendige geladene Reste, Arg90 und Asp302 haben geringeres Gewicht, ebenso die �neuen� (S.meliloti-spezifischen) Reste Glu300 und Ser301.
b) Ladungsumkehr zwischen bestimmten Resten kompensiert die Defekte der Einzelmutationen (Suppression). Dies trifft für die Kombinationen Glu300Arg/Ser301Ala-Arg90Glu und Glu300Arg/Ser301Arg-Arg90Glu zu. Die Ergebnisse zeigen, daß elektrostatische (Coulomb-) Wechselwirkungen zwischen antagonistischen Ladungen entscheidend für die Kraftübertragung vom Stator (MotA) auf den Rotor (FliG) sind.
c) Reste, welche die Chemokinesis (Geschwindigkeitserhöhung bei taktischer Stimulation) betreffen. Die Neutralisation der MotA-Reste Arg90 (Ala) und Glu98 (Gln) führte zum Verlust der Chemokinesis, teilweise auch eine Ladungsumkehr des FliG-Rests Asp302 (Lys). Folglich reicht eine MotA-FliG Coulomb-Wechselwirkung für die Aufrechterhaltung der Rotation mit hoher Geschwindigkeit aus, die Kombination von zwei wechselwirkenden Ladungspaaren ist aber für die Geschwindigkeitsvariation (�Bremse�) entscheidend.
(4) Eine C-terminale Fusion von FliG mit dem MS-Ring (FliF) resultierte in reduzierter Geschwindigkeit und Chemokinesis. Dieser Befund wird als Beleg für eine eingeschränkte Fähigkeit von FliG zur Konformationsänderung interpretiert, die als Voraussetzung für die Geschwindigkeitsvariation gilt.
(5) Aus den Daten wurde ein Funktionsmodell des S.meliloti-Motors etabliert, in dem die Coulomb-Wechselwirkungen zwischen MotA und FliG die entscheidende Rolle bei Rotation und Chemokinesis spielen.
Translation of the abstract (English)
Sinorhizobium meliloti flagella, in contrast to their Escherichia coli counterparts, rotate solely in the clockwise sense. A swimming cell alters its direction by rotary speed variation of single flagella and thus, dissociation of the organised flagella bundle. The S.meliloti flagellar motor contains several conserved components, e.g. MotA, MotB, FliM, FliN and FliG. Additionally, new Mot ...
Translation of the abstract (English)
Sinorhizobium meliloti flagella, in contrast to their Escherichia coli counterparts, rotate solely in the clockwise sense. A swimming cell alters its direction by rotary speed variation of single flagella and thus, dissociation of the organised flagella bundle.
The S.meliloti flagellar motor contains several conserved components, e.g. MotA, MotB, FliM, FliN and FliG. Additionally, new Mot proteins, namely MotC, MotD and MotE, which represent essential characteristics of the S.meliloti flagellar motor (and related counterparts), were identified (Sourjik et al., 1998). Among these, MotC was analysed in this study.
However, the relations of certain charged amino acid residues at the proton channel (MotA) � rotor (FliG) interface emerged as crucial for the rotational pattern and thus for the movement of swimming S.meliloti cells. Therefore, special emphasis was laid on the genetic, protein-biochemical and functional analysis of these residues.
Main results and conclusions of this work can be summarized as follows:
1) Previously unknown Rhizobium lupini H13-3 motA, motC and fliG sequences were
revealed and compared with known orthologues of S.meliloti, Agrobacterium tumefaciens and Mesorhizobium loti, defining conserved domains.
2) The periplasmic MotC component binds to the MotB (channel) protein, thereby securing functioning of the energizing proton channel. MotC possibly serves as a �proton trap� or �pmf sensor�, as S.meliloti cells are capable of swimming at higher pH values (up to pH 9.5) than E.coli cells (up to pH 9.0). Functional defects created by deletions in the central part of MotC were shown to be caused mainly by the instability of the mutant proteins. Therefore, additional studies with (stable) substitutions of MotC single residues will have to be carried out.
3) With targeted mutagenesis, 68 single, double and triple exchanges of the conserved charged residues Arg90 and Glu98 (MotA) and Arg294, Glu300, Ser301 and Asp302 (FliG) were generated, and the swarming and swimming abilities of the resulting mutants were determined. From the results, three mutant classes can be inferred:
a) Residues essential for flagellar rotation, as their absence causes stop or significant reduction of rotational speed. In this category, Glu98 and Arg294 are absolutely crucial residues, Arg90 and Asp302 are of minor importance, as well as �new� (S.meliloti specific) residues Glu300 and Ser301.
b) Charge reversals between certain residues compensate the defects of the single mutations (suppression). This applies for the combinations Glu300Arg / Ser301Ala � Arg90Glu and Glu300Arg / Ser301Arg � Arg90Glu. The results show that electrostatic (Coulomb) interactions between antagonistic charges are crucial for the force transmission from the stator (MotA) to the rotor (FliG).
c) Residues that affect chemokinesis (speed acceleration upon tactic stimulation). Neutralization of the MotA residues Arg90 (Ala) and Glu98 (Gln) results in loss of chemokinesis, charge reversal of the FliG residue Asp302 (Lys) impairs chemokinesis. Thus, one MotA � FliG Coulomb interaction is sufficient for maintaining high-speed rotation, but the combination of two interacting charge-pairs is crucial for speed variation (�brake�).
4) A C-terminal fusion of FliG and the MS ring (FliF) resulted in both reduced speed and chemokinesis. These findings indicate a limited ability of FliG to change its conformation, which is required for speed variation.
5) Based on these data, a functional model of the S.meliloti motor was established, in which the Coulomb interactions between MotA and FliG play the crucial role in rotation and chemokinesis.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 13:26
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