Charakterisierung einer neuen Isoform des humanen p75TNF-Rezeptors

Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Date:	13 March 2005
Referee:	Daniela (Prof. Dr.) Männel
Date of exam:	16 February 2005
Institutions:	Medicine > Lehrstuhl für Immunologie Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical/Medicinal Chemistry I (Prof. Elz)
Keywords:	Tumor-Nekrose-Faktor / Rekombinantes Protein , Tumor-Nekrose-Faktor , Tumor-Nekrose-Faktor <alpha> , Immunologie , Enzyme-linked immunosorbent assay , Apoptosis , Schedding , Antikörper , Cytotoxischer Antikörper , TNFR , CD120b , Splicing , TNFR2 , p75TNFR , TNFR , CD120b , Splicing , TNFR2 , p75TNFR
Dewey Decimal Classification:	500 Science > 540 Chemistry & allied sciences
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	10294

Abstract (German)

Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) spielt eine wichtige Rolle bei Entzündungen und Immunreaktionen, wobei TNF über zwei membranständige TNF Rezeptoren (TNFR), den TNFR1 (p55TNFR) und den TNFR2 (p75TNFR), wirkt. Während Aktivierung des p55TNFR klassische Apoptose-Signalwege induziert, ist über die zelluläre Auswirkungen einer Aktivierung des p75TNFR nur bekannt, dass das Adapterprotein TRAF2 rekrutiert ...

Abstract (German)

Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) spielt eine wichtige Rolle bei Entzündungen und Immunreaktionen, wobei TNF über zwei membranständige TNF Rezeptoren (TNFR), den TNFR1 (p55TNFR) und den TNFR2 (p75TNFR), wirkt. Während Aktivierung des p55TNFR klassische Apoptose-Signalwege induziert, ist über die zelluläre Auswirkungen einer Aktivierung des p75TNFR nur bekannt, dass das Adapterprotein TRAF2 rekrutiert wird, was wiederum NFkappaB induziert. Bei der Untersuchung des p75TNFR Promotors wurde eine neue Isoform dieses Rezeptors indentifiziert, die durch alternatives Splicing des 1. Exons entsteht. Durch diesen Splice- Vorgang wird das Signalpeptid durch eine Präsequenz ersetzt, die nach eingehender Datenbank Recherche nicht als Signalpeptid fungiert. Die somit resultierende Isoform wurde deswegen als �intracellular� (=ic)p75TNFR bezeichnet. Die genaue subzelluläre Lokalisierung, die Aktivierung durch den Liganden TNF und proteinchemische Charakterisierung des icp75TNFR sind Gegenstand dieses Projekts.
Um Zellinien zu generieren, die jeweils eine der beiden Isoformen überexprimieren, wurde die Technik des retroviralen Gentransfers gewählt. Hierfür wurde die jeweilige cDNA in den proviralen Vektor pQCXIP kloniert, und ein Protokoll für die Virusproduktion und Infektion der Zielzellen etabliert.

An den stabil transduzierten Zellinien wurden Antikörper gegen verschiedene Epitope des p75TNFR getestet um ein optimales Paar für die Immunpräzipitation zu finden. Im Western Blot stellte sich auf Proteinebene das icp75TNFR Gen-Produkt schwerer dar, was dafür spricht, dass die Präsequenz beim icp75TNFR nicht abgespalten wird, in Gegensatz zum Signalpeptid desp75TNFR, das bereits im ER abgespalten wird.

Außerdem liegt vom icp75TNFR eine große Menge unglykosyliert vor, ein weiteres Indiz für intrazelluläre Retention des Proteins.
Mit Zellen, die stabile eYFP- Fusionsproteine des jeweiligen Rezeptors exprimieren war es möglich Life cell imaging am Fluoreszenzmikroskop durchzuführen. Wie erwartet stellte sich der p75TNFR als vorwiegend membranständig dar, während der icp75TNFR punktuelle perinucläre Verteilung zeigte. Vereinzelt konnte mit time-lapse- Aufnahmen ein Transport dieser Vesikel zur Zellmembran beobachtet werden. Weitere Färbungen mit Kompartiment- spezifischen Farbstoffen weisen auf Kolokalisierung des icp75TNFR mit dem Golgi Apparat und Endosomen hin. Durchflusszytometerische Messungen zeigen Membranexpression für beide Isoformen, wobei der icp75TNFR jedoch in weit geringerem Ausmaß als die p75TNFR Isoform auf der Membran lokalisiert ist. Die Extrazellulärdomänen beider Isoformen werden MMP-abhängig und TNF-induzierbar im Zellüberstand mittels ELISA gefunden, wobei ebenfalls mehr löslicher p75TNFR von p75TNFR- transduzierten als von icp75TNFR- transduzierten Zellen entsteht.

Translation of the abstract (English)

Tumor necrosis factor (TNF) plays an important role in inflammation and immune responses. The effects of TNF are mediated through two distinct membrane bound receptor molecules with apparent molecular masses of 55 kDa (p55TNFR, TNFR type 1) and 75 kDa (p75TNFR, TNFR type 2), respectively. Whereas activation of p55TNFR induces the classical apoptotic pathways, the precise cellular effects of ...

Translation of the abstract (English)

Tumor necrosis factor (TNF) plays an important role in inflammation and immune responses. The effects of TNF are mediated through two distinct membrane bound receptor molecules with apparent molecular masses of 55 kDa (p55TNFR, TNFR type 1) and 75 kDa (p75TNFR, TNFR type 2), respectively. Whereas activation of p55TNFR induces the classical apoptotic pathways, the precise cellular effects of interaction of TNF with p75TNFR have not been completely identified. Activation of NFkappaB via TNF- p75TNFR interaction in a TRAF2 (TNF receptor associated factor 2)- dependent manner has been demonstrated.
While analyzing regulation of the p75TNFR expression we identified a novel p75TNFR splice form, termed icp75TNFR, which is generated by the use of an alternative transcriptional start site within the p75TNFR gene and differs only in the expression of the first exon coding for the signal peptide.
Studies with YFP-tagged icp75TNFR constructs showed low membrane staining, and distinct intracellular localization. Colocalization with Golgi complex, TGN and endogenous TNF was observed.
To a lower extend than the ectodomain of p75TNFR the extracellular domain of icp75TNFR was cleaved by MMP´s and released into the supernatant as a functional TNF inhibitor.

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