| License: Publishing license for publications excluding print on demand (23MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-6066
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.10366
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 21 December 2005 |
| Referee: | Daniela N. (Prof. Dr.) Männel |
| Date of exam: | 13 December 2005 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Immunologie Chemistry and Pharmacy > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik |
| Keywords: | Tumor-Nekrose-Faktor , Polymerase-Kettenreaktion , Rekombinantes Protein , Repetitive DNS , Alu-Element , intrazelluläre Spleissvariante , icp75TNF-Rezeptor , Alu-element , intracellular splice variant , icp75TNF-receptor |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 10366 |
Abstract (German)
Sowohl im humanen als auch im Maus-System war in unserem Labor eine intrazellulär lokalisierte Isoform des p75TNFR entdeckt worden, die durch Verwendung eines weiter 5� gelegenen alternativen Promotors und anschließendem alternativen Spleissen generiert wird. Dadurch entsteht im Falle des humanen icp75TNFR ein Protein, das an Stelle von Exon 1 ein alternatives Exon 1a enthält, welches durch ...
Abstract (German)
Sowohl im humanen als auch im Maus-System war in unserem Labor eine intrazellulär lokalisierte Isoform des p75TNFR entdeckt worden, die durch Verwendung eines weiter 5� gelegenen alternativen Promotors und anschließendem alternativen Spleissen generiert wird. Dadurch entsteht im Falle des humanen icp75TNFR ein Protein, das an Stelle von Exon 1 ein alternatives Exon 1a enthält, welches durch Exonisierung eines Alu-Elementes entstanden ist. In der Maus wird dagegen alternativ zu Exon 1 eine untranslatierte Region direkt an Exon 2 gespleisst, von dem ein im richtigen Leseraster gelegenes ATG als Startpunkt der Proteinbiosynthese verwendet werden kann. Somit verkürzt sich das Protein N-terminal um 26 Aminosäuren.
Durch Untersuchungen zur Regulation und dem spezifischen knock down zunächst des humanen icp75TNFR, sollte ein näherer Einblick in die Funktion der neuen Isoform erzielt werden. Nachdem sich dies wegen der geringen Expression des Rezeptors als äußerst schwierig darstellte, wurde der icp75TNFR im Maus-System in die Untersuchungen mit einbezogen.
Im Human-System konnte durch Optimierung der RT-PCR und anschließender spezifischer Hybridisierung zwar der Nachweis für den humanen icp75TNFR reproduzierbar geführt werden, es handelt sich aber in allen untersuchten Zelllinien und Primärzellen um eine sehr geringe Expression. Zudem wird die spezifische Detektion der Isoform zusätzlich durch die hohe Homologie zur AluJo-Sequenz erschwert, die in hoher Kopienzahl in den RNA-Präparationen repräsentiert ist.
Der Ribonuclease Protection Assay erwies sich als Methode zum Nachweis für den hicp75TNFR auf Grund fehlender Amplifikations-Schritte als zu wenig sensitiv und auf Grund der hohen Übereinstimmung zwischen Exon 1a- und Alu-Sequenz als nicht geeignet.
Mittels quantitativer Real Time RT-PCR, obwohl per se nicht weniger sensitiv als eine herkömmliche RT-PCR-/Southern-Methode, konnte im Falle des hicp75TNFR ebenfalls kein Transkript für diese Isoform detektiert werden, was noch einmal die geringe Expression unterstreicht.
Der funktionelle knock down des hicp75TNFR, der mittels RNA-Interferenz vermittelt werden sollte, konnte wegen der starken Einschränkungen, wieder bedingt durch die hohe Übereinstimmung zwischen einerseits dem hp75TNFR und andererseits dem Alu-Element, ebenfalls nicht erfolgreich durchgeführt werden.
Im Maus-System, wo die Entstehung der intrazellulären Variante des p75TNFR nicht durch Insertion eines repetitiven DNA-Elementes in den p75TNFR-Genlokus verursacht ist, konnte ebenfalls nur eine geringe Expression des icp75TNFR detektiert werden, die mRNA war aber reproduzierbar in einigen Zellen mittels RT-PCR-/Southern-Hybridisierung nachweisbar.
Im Gegensatz zum humanen System gelang in der Maus auch in der quantitativen Real Time RT-PCR ein positiver Nachweis für den icp75TNFR, allerdings geschah dies am Rande der Nachweisgrenze, womit wegen der großen Schwankungen einzelner PCR-Reaktionen keine quantitativen Aussagen getroffen werden konnten.
Die biochemische Charakterisierung des micp75TNFR zeigte, dass die fehlenden 26 Aminosäuren aus Exon 2 in einem um ca. 20 kDa verringertem Molekulargewicht resultieren. Die Lokalisierung des micp75TNFR ist vorwiegend intrazellulär, wie im Human-System konnte ein gewisser Teil des Rezeptors dennoch auf der Zellmembran detektiert werden. Dadurch ist eine Prozessierung des micp75TNFR in seine lösliche Form zwar mehr als wahrscheinlich, auf Grund methodischer Unzulänglichkeiten aber nicht zweifelsfrei nachweisbar.
Die funktionelle Charakterisierung des micp75TNFR mittels TNF-induziertem Zytotoxizitäts-Test zeigte keinen Schutzeffekt der neuen Isoform vor dem durch den p55TNFR ausgelösten Zelltod, obwohl dies für den humanen icp75TNFR, durch Abfangen des toxischen TNF und dadurch verursachte kompetitive Hemmung des Todesrezeptors (p55TNFR), nachgewiesen werden konnte.
In Untersuchungen zur Ligandbindung der neuen p75TNFR-Isoform konnte schließlich gezeigt werden, dass weder lösliches noch transmembranäres Maus-TNF an den micp75TNFR bindet und er damit nicht aktiviert werden kann. Dies erklärt auch den fehlenden Schutz im TNF-Zytotoxizitäts-Test.
Vor allem unter Berücksichtigung der geringen Expression des micp75TNFR ist die Zuweisung einer biologischen Bedeutung schwierig und vielleicht nur über die Generierung einer icp75TNFR-gendefizienten Maus und deren Phänotypisierung möglich.
Translation of the abstract (English)
TNF is a pleiotropic cytokine that induces a broad spectrum of cellular and pathological effects by binding to two different cell surface receptors, TNFR1/p55TNFR and TNFR2/p75TNFR. In this work a new isoform of the p75TNFR in humans and mice is described and its biological relevance is examined. The new isoform is generated by the use of an alternative transcriptional start site and alternative ...
Translation of the abstract (English)
TNF is a pleiotropic cytokine that induces a broad spectrum of cellular and pathological effects by binding to two different cell surface receptors, TNFR1/p55TNFR and TNFR2/p75TNFR. In this work a new isoform of the p75TNFR in humans and mice is described and its biological relevance is examined. The new isoform is generated by the use of an alternative transcriptional start site and alternative splicing that leads to the loss of the signal peptide, resulting in a protein with primarily intracellular localisation and therefore was termed intracellular (ic)p75TNFR.
In the human system exon 1 (signal peptide) is replaced by an alternative exon 1a that emerged from the exonisation of an Alu-element, a repetitive DNA-sequence, belonging to the family of short interspersed nuclear elements (SINE).
By the use of RT-PCR and subsequent Southern hybridisation the mRNA for the human icp75TNFR (hicp75TNFR) had been detected earlier, but quantification by either ribonuclease protection assay or quantitative real time RT-PCR failed because of the low expression level of hicp75TNFR-mRNA and high background of contaminating Alu-sequence within the RNA preparations.
In addition to detection and quantification of the icp75TNFR-isoform, a functional knock- down of hicp75TNR-mRNA by RNA-interference was tried, but was not successful, because of the high homology between this isoform and the Alu-sequence.
The mRNA for mouse icp75TNFR (micp75TNR), which uses an alternative 5� UTR and an in frame ATG within exon 2 for a start site of protein biosynthesis, was detected in various tumor cell lines and also in primary mouse cells, but again at a very low expression level. Therefore, like in the human system quantification by real time RT-PCR failed.
Characterisation of the recombinant protein demonstrated the primarily intracellular localisation of micp75TNFR but in addition, as in the human system, showed cell suface expression to a certain extent. In Western blot analysis the apparent molecular weight of the micp75TNFR was slightly smaller because of the truncation of Exon 2. Experiments examining the ligand binding properties of the truncated isoform showed loss of binding capacity for both, soluble and membrane TNF. Thus, the function of the new isoform of the p75TNFR in the mouse is restricted to be dominant negative.
In the human system, a distinct function may develop throughout the next million years of evolution as was shown for other alternative splice variants emerging from Alu-sequences.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 13:11
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