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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-5347
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 2 August 2006 |
| Referee: | Peter (Prof. Dr.) Hegemann |
| Date of exam: | 8 July 2005 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie |
| Keywords: | rekombinantes Protein , Genexpression , Sekretion , Chlamydomonas reinhardii , Luciferasen , Gentransfer , Alkanalmonooxygenase , , recombinant proteins , expression system , secretion system , Chlamydomonas reinhardtii , luciferase |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 580 Botanical sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 10396 |
Abstract (German)
In dieser Arbeit wurde erstmalig die Verwendung der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii als System zur Expression und Sekretion rekombinanter Proteine anhand des leicht nachweisbaren Reportergens Luciferase aus Renilla reniformis untersucht. Bei dem dabei verwendeten crLuc - Gen handelt es sich um ein synthetisches Gen, welches gemäß der Codon Usage von C.reinhardtii optimiert wurde. Das crLuc - ...
Abstract (German)
In dieser Arbeit wurde erstmalig die Verwendung der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii als System zur Expression und Sekretion rekombinanter Proteine anhand des leicht nachweisbaren Reportergens Luciferase aus Renilla reniformis untersucht. Bei dem dabei verwendeten crLuc - Gen handelt es sich um ein synthetisches Gen, welches gemäß der Codon Usage von C.reinhardtii optimiert wurde. Das crLuc - Gen wurde zuerst in Escherichia coli exprimiert und das cRLuc - Protein nativ über Affinitätschromatographie gereinigt. Damit konnte ein Proteinmengen - und Aktivitätsstandard zur Quantisierung der in der Alge zu exprimierenden cRLuc generiert werden.
Das Modellprotein cRLuc konnte erfolgreich in der Grünalge exprimiert werden. Die Verwendung des Leaderpeptids der extrazellulären Arylsulfatase aus C.reinhardtii führte zur Sekretion der exprimierten Luciferase in den Kulturüberstand. Die rekombinant in E.coli exprimierte Luciferase diente als Standard, um sowohl die Menge an intrazellulär exprimierter Luciferase (60 � 90µg/g Algenfrischgewicht bzw. 520 � 790µg/g Algentrockengewicht) als auch die Menge an sezerniertem Protein (75ng/l Algenkultur der OD800 ~ 0,7; dies entspricht etwa 29ng/g Algenfrischgewicht bzw. 260ng/g Algentrockengewicht) abzuschätzen.
Die Selektion in den Algen erfolgte dabei zunächst durch Kotransformation mit einem zusätzlichen Selektionsmarkergen enthaltenden Plasmid, wobei die Koexpressionsraten sehr gering waren (zwischen 6,5 bis 26%). Die Koexpressionsrate konnte durch Verwendung von Plasmiden, die sowohl das zu exprimierende Transgen, als auch das Selektionsmarkergen enthalten, verbessert werden. Die Verwendung der Resistenzmarkergene aphVIII und ble (Plasmide pAES7a/b und pAES8a/b) hat sich (bei Transformation linearisierter Plasmide) aber als nicht geeignet herausgestellt, bei Verwendung des endogenen Auxotrophiemarkergens arg7.8 (pAES9 und pAES10, sowie die Plasmide pAES12 bis pAES19) konnte dagegen eine deutliche Verbesserung der Koexpressionsrate (³46 bis 80%) erzielt werden. Das arg7.8 - Gen ist also als Selektionsmarker zu bevorzugen und bietet den Vorteil, auf Antibiotika - Selektionsmarker verzichten zu können, was auch im Hinblick auf eine Produktion im Großmaßstab bzw. im offenen Kultursystem günstiger ist.
Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Integration von Introns in die kodierende Region des Transgens eine deutliche Verbesserung der Expression zur Folge hat. Dabei hat sich die Kombination aus allen drei Introns des endogenen rbcS2 - Gens in ihrer natürlichen Abfolge als besonders vorteilhaft herausgestellt (Verbesserung der Expression von cRLuc um den Faktor 3 bis 4,5). Anhand eines Fusionsgens, bestehend aus dem Gen für einen scFv - Antikörper (sg3) und dem Luciferasegen mit bzw. ohne zusätzlich integrierte Intronsequenzen konnte dieser positive Einfluß der Introns noch einmal verdeutlicht werden.
Eine Anreicherung aktiver Luciferase aus dem Kulturüberstand transgener Algen konnte mit Hilfe eines HIS6 - bzw. StrepII - tag erreicht werden. Durch Affinitätschromatographie ist eine Anreicherung um den Faktor 4 bis 8 bei Verwendung des HIS6 - tags und bis zu einem Faktor von ca. 55 bei Verwendung des StrepII - tags möglich.
Um alle bisherigen Verbesserungen des Expressionssystems zu testen, wurde die Expression des Fusionsproteins Sg3-cRLuc-HIS untersucht. Die Integration des Selektionsmarkergens arg7.8 in den Expressionsvektor führte in diesem Fall ebenfalls zu einer wesentlichen Verbesserung der Koexpressionsrate, ³48% der Arginin prototrophen Transformanten wiesen eine signifikante Lumineszenz auf. Das Einbringen zusätzlicher Intronsequenzen in das Luciferasegen führt zu einer Verbesserung der gemessenen Luciferaseaktivität des Fusionsproteins um den Faktor 19. Das Fusionsprotein Sg3-cRLuc-HIS wurde jedoch trotz Anwesenheit der ars � Leadersequenz nicht in den Kulturüberstand sezerniert, konnte aber mit Western Blot Analyse im Gesamtzellextrakt nachgewiesen werden.
Im Laufe dieser Arbeit ist es gelungen, die Koexpressionsrate zu verbessern und die Expressionsrate zu erhöhen, so dass eine Produktion rekombinanter Proteine in C.reinhardtii im Großmaßstab möglich wird.
Translation of the abstract (English)
This work describes the use of the green alga Chlamydomonas reinhardtii for the expression and secretion of a recombinant reportergene. The codon optimized luciferase from Renilla reniformis was chosen as reportergene, because of the quick and easy detection methods available. This synthetic gene was first expressed in Escherichia coli and the native protein was purified by affinity ...
Translation of the abstract (English)
This work describes the use of the green alga Chlamydomonas reinhardtii for the expression and secretion of a recombinant reportergene. The codon optimized luciferase from Renilla reniformis was chosen as reportergene, because of the quick and easy detection methods available. This synthetic gene was first expressed in Escherichia coli and the native protein was purified by affinity chromatography. This preparation was later to be used as a protein amount and protein activity standard for quantisation of cRLuc expressed in the algae.
The reporterprotein cRLuc was successfully expressed in the algae. Use of the leaderpeptid sequence from the endogenous arylsulfatase - gene led to the secretion of cRLuc into the surrounding culture media. The in E.coli recombinantly expressed cRLuc protein was used to quantify the amount of intracellularly luciferase expressed in alga (60 � 90µg/g algal fresh weight, equals 520 � 790µg/g algal dry weight) as well as the amount of secreted luciferase (75ng/l algal culture with an OD800 ~ 0,7; equals 29ng/g algal fresh weight, equals 260ng/g algal dry weight).
The first algal transformants were selected by cotransformation with a plasmid containing the selectionmarkergene. Coexpression rates were rather small (between 6,5 and 26%). Use of plasmids which contained the transgene as well as a selectionmarker improved the coexpression rates. Use of the resistence - markergenes aphVIII and ble (plasmids pAES7a/b and pAES8a/b) was not successful. But use of the endogenous auxotrophic markergene arg7.8 (plasmids pAES9 and pAES10 as well as plasmids pAES12 to pAES19) led to a tremendous improvement concerning the rate of coexpression (46 to 80%). So to express transgenes in C. reinhardtii the arg7.8 markergene should be preferred as a selection marker. This poses the additional advantage that no antibiotics - resistancemarkergene is required, which is preferable especially for the production on a large scale or in an open system.
It has also been shown, that the integration of introns into the coding region of the transgene leads to a distinct increase in expression. The combination of all three introns from the rbcS2 gene in the natural succession showed the best results (expression of cRLuc increased by a factor of 3 to 4,5). This positive influence of additionally integrated introns on transgene expression could also be shown for a fusiongene which combined the gene of an scFv � antibody (sg3) fused in frame with the luciferase - gene with or without additional intron sequences.
Active HIS6 - or STREPII � tagged luciferase was enriched from the culture supernatant of transgenic algae. Purification by affinity chromatography led to an enrichment by a factor of 4 to 8 using the HIS6 � tag and up to a factor of 55 by using the StrepII � tag.
The improvements of the expression system were tested by expressing the fusionprotein SG3-cRLuc-HIS. The integration of the selectionmarkergene arg7.8 into the expressionvector improved the coexpression rate, ³48% of the transformants showed significant luminescence activity. The introduction of additional introns into the sequence of the luciferase led to an increase in measured activity of the fusionprotein by a factor of 19. Even though the gene construct coding for the fusionprotein contained the sequence for the arylsulfatase encoded leaderpeptide, the expressed protein was not secreted into the culture medium, but could be detected by western blotting in whole cell lysates.
This thesis describes two major improvements in expressing recombinant proteins in green algae. Coexpression rates as well as expression rates were increased, which makes the production of recombinant proteins in C.reinhardtii feasible.
Metadata last modified: 04 Jun 2018 03:18
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