| Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen ohne Print on Demand (9MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-5911
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.10404
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 22 November 2006 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Achim (Prof. Dr.) Göpferich |
| Tag der Prüfung: | 18 November 2005 |
| Institutionen: | Chemie und Pharmazie > Institut für Pharmazie > Lehrstuhl Pharmazeutische Technologie (Prof. Göpferich) |
| Stichwörter / Keywords: | Transfektion , Polyethylenimin , Durchflußcytometrie , Konfokale Mikroskopie , Laser-Rastermikroskopie , Konfokales Laser Scanning Microskop , Gene delivery , polyethylenimine , flow cytometry , confocal laser scanning microscopy |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 10404 |
Zusammenfassung (Englisch)
With recent advances in molecular biology and the sequencing of the human genome, nucleic acids are expected to engage a pivotal position in the development of novel therapeutic concepts. Although viral vectors are very effective and are capable of many of the required tasks for efficient gene transfer, their broad use is limited by severe safety risks [1,2]. Therefore, this work focused on the ...
Zusammenfassung (Englisch)
With recent advances in molecular biology and the sequencing of the human genome, nucleic acids are expected to engage a pivotal position in the development of novel therapeutic concepts. Although viral vectors are very effective and are capable of many of the required tasks for efficient gene transfer, their broad use is limited by severe safety risks [1,2]. Therefore, this work focused on the use of polymers as non-viral vehicles for nucleic acid delivery. Among various polymers, polyethylenimine (PEI) has become a gold standard for nucleic acid delivery [3]. The relatively high transfection efficiency of branched PEI (BPEI) -based delivery systems is seriously afflicted by the cytotoxicity of the polymer. In contrast, the linear form (LPEI) has a particularly high gene expression accompanied by a lower cytotoxicity, but nevertheless the transfection efficiency of LPEI 22 kDa (ExGen®) cannot be enhanced beyond a certain limit due to cytotoxicity. Therefore, the ultimate goal of this thesis was to identify strategies towards effective PEI-based delivery systems with low cytotoxicity for in vitro use.
The first objective was to overcome the frequent restriction that high transfection efficiency is limited by the cytotoxicity of the non-viral carrier. We explored the potential of utilizing LPEIs with a molecular weight (MW) ranging from 1.0 to 9.5 kDa to overcome this limitation (Chapter 2). This study envisioned the decoupling of transfection efficiency from cytotoxicity and demonstrated that LPEIs with low MW are more efficient and significantly less toxic than their high MW counterparts in CHO-K1 cells in vitro. A follow-up study focused on the uptake and intracellular stability of various LPEI - polyplexes and plasmid DNA in order to investigate differences relevant for their efficacy. Furthermore, the influence of the ionic strength of the polyplex formation medium and presence of serum during the transfection process on the transfection efficiency was evaluated (Chapter 3). The results showed that we have a very robust system for LPEI-based nucleic acid delivery that is widely independent of external influences and suitable for routine transfection experiments. The interaction of polymer and plasmid DNA in living cells was additionally evaluated by fluorescence resonance energy transfer (FRET) -based techniques (Chapter 4).
Furthermore, we hypothesized that a bioreversible crosslinking of low MW LPEIs would raise the polymer�s efficacy due to the higher MW, while the biodegradable linkages would undergo intracellular breakdown and hence minimize toxicity (Chapter 5). Our results proved the hypothesis: the most effective biodegradable PEI (LR-PEI) was capable of gene delivery in 27-fold more cells than the non-degradable starting material and moreover, the maximum transfection efficiency achieved in CHO-K1 cells had a value of about 73%, which is much higher than that of the LPEI derivative of similar MW. These biodegradable PEIs can be counted among the most effective polymer-based gene delivery vehicles, because the efficacy was nearly 3-fold higher than with BPEI 25 kDa and LPEI 22 kDa, to which newly synthesized polymers are usually compared. LR-PEI-mediated gene delivery was dependent on intracellular reduction and could be modulated by manipulation of the number of stabilizing bonds. After biodegradable PEI-based polyplexes had successfully been applied for the transfection of various cell lines in vitro, the next step was to evaluate their gene transfer ability in human primary cells and in a �hard-to-transfect� cell line (Chapter 6). In dendritic cells the transfection efficiency was nearly negligible and also accompanied by a remarkable toxicity. Human chondrocytes were more susceptible to PEI-based transfection, but the efficacy was much lower compared to the cell lines tested in Chapter 5.
Last mentioned, we showed that the PEI backbone is a necessary prerequisite for efficient polymer-based gene delivery by the investigation of per-N-methylated PEI (Chapter 7).
References: 1. Marshall E. Science 2002; 298: 510-511. 2. Sadelain M. Gene Ther 2004; 11: 569-573. 3. Boussif O, Lezoualc'h F, Zanta MA, Mergny MD, Scherman D, Demeneix B, Behr J. Proc Natl Acad Sci U S A 1995; 92: 7297-7301.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Aufgrund der jüngsten Fortschritte in der Molekularbiologie und der abgeschlossenen Sequenzierung des menschlichen Genoms, erhofft man sich, dass Nukleinsäuren eine Schlüsselposition in der Entwicklung neuer therapeutischer Konzepte einnehmen. Obwohl Viren sehr effektive Transporter darstellen und besonders geeignet sind, viele der an sie gestellten Anforderungen für einen effizienten Gentransfer ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Aufgrund der jüngsten Fortschritte in der Molekularbiologie und der abgeschlossenen Sequenzierung des menschlichen Genoms, erhofft man sich, dass Nukleinsäuren eine Schlüsselposition in der Entwicklung neuer therapeutischer Konzepte einnehmen. Obwohl Viren sehr effektive Transporter darstellen und besonders geeignet sind, viele der an sie gestellten Anforderungen für einen effizienten Gentransfer zu erfüllen, ist ihrer breite Anwendung durch schwerwiegende Sicherheitsrisiken begrenzt [1,2]. Deshalb richtete diese Arbeit ihren Fokus auf Polymere als nicht-virale Trägersysteme für den Gentransfer von Nukleinsäuren. Unter den Polymeren wurde Polyethylenimin (PEI) zum Goldstandard für Nukleinsäuretransporter [3]. Obwohl verzweigtes PEI (BPEI) eine relative hohe Transfektionseffizienz besitzt, ist das Übertragungssystem ernsthaft durch die Zytotoxizität des Polymers beeinträchtigt. Im Gegensatz dazu weist die lineare verwandte Form (LPEI) eine besonders hohe Genexpression auf, die mit einer niedrigeren Zytotoxizität einhergeht. Aber nichtsdestotrotz kann die Transfektionseffizienz von LPEI 22 kDa aufgrund seiner Toxizität nicht über eine bestimmtes Maß gesteigert werden. Deshalb war das Ziel dieser Dissertation, Strategien für effektive PEI basierter Übertragungssyste mit niedriger Toxizität für den in vitro Gebrauch zu entwickeln.
Das erste Zwischenziel stellte die Überwindung einer bisher allgemeingültigen Begrenzung dar, daß eine hohe Transfektionseffizienz durch die Toxizität des nicht-viralen Übertragungssystems limitiert ist. Dazu untersuchten wir das Potential von LPEIs mit einem Molekulargewicht (MW) von 1,0 bis 9,5 kDa (Kapitel 2). Diese Versuchsreihe zeigte die Entkopplung von Transfektionseffezienz und Zytotoxizität und bewies, dass LPEIs mit niedrigem MW in CHO-K1 Zellen in vitro effizienter und signifikant weniger toxisch sind als ihre hochmolekularen Verwandten. Folgeversuche konzentrierten sich auf die Aufnahme und intrazelluläre Stabilität von LPEI-Polyplexen und Plasmid DNA. Weiterhin wurde der Einfluß der Ionenstärke des Polyplexbildungsmediums und die Anwesenheit von Serum während des Transfektionsprozesses auf die Transfektionseffizienz untersucht (Kapitel 3). Die Ergebnisse zeigten, daß LPEIs ein sehr robustes System für den Transfer von Nukleinsäuren darstellen, das weitgehend unabhängig von äußeren Einflüssen ist und für Transfektionsexperimente im Routinebetrieb geeignet ist. Die Interaktion von Polymer und Plasmid-DNA in lebenden Zellen wurde zusätzlich mit auf Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET)- basierenden Techniken untersucht (Kapitel 4).
Weiterhin stellten wir die Hypothese auf, dass ein bioreversibles Quervernetzen von LPEIs mit niedrigem MWs die Effizienz des Polymers aufgrund des resultierenden höheren MWs steigern würde, wohin gegen die bioabbaubaren Querverbindungen in der Zelle aufbrechen und somit die Toxizität minimiert würden (Kapitel 5). Unsere Ergebnisse bestätigten diese Hypothese. Das effektivste bioabbaubare PEI (LR-LPEI) transfizierte 27 mal mehr Zellen als das nichtabbaubare Ausgangsmaterial, darüber hinaus erreichte die maximale Transfektionseffizienz in CHO-K1 Zellen einen Wert von ungefähr 73%, der viel höher ist als der von einem LPEI-Derivat mit ähnlichem MW. Diese bioabbaubaren PEIs können zu den effektivsten polymerbasierten Nukleinsäureüberträgersystemen gezählt werden, weil ihre Effizienz dreimal höher ist als die von BPEI 25 kDa und LPEI 22 kDa, mit denen neu synthetisierte Polymere normalerweise verglichen werden. Ihr Gentransfer war abhängig von einer intrazellulären Reduktion und änderte sich mit der Anzahl der Quervernetzungen. Nachdem bioabbauere PEI-basierte Polyplexe erfolgreich für die Transfektion von verschiedenen Zelllinien in vitro angewendet wurden, wurde als nächstes ihre Kapazität für den Gentransfer in human primären Zellen und in eine schwer zu transfizierenden Zelllinie untersucht (Kapitel6). In dendritischen Zellen war die Transfektionseffizienz vernachlässigbar gering und wurde von einer nicht unerheblichen Toxizität begleitet. Humane Chondrozyten waren für den PEI-basierten Gentransfer besser zugänglich, aber die Effizienz war viel niedriger als in den Zelllinien, die in Kapitel 5 getestet wurden.
Zuletzt zeigten wir an Untersuchungen von per-N-methylierten PEI, daß das PEI Grundgerüst ein essentieller Bestandteil für einen effizienten PEI-basierten Gentransfer ist. Literatur: 1.Marshall E.Science 2002;298:510-511. 2.Sadelain M.GeneTher2004;11:569-573. 3.Boussif O, Lezoualc'h F, Zanta MA, Mergny MD, Scherman D, Demeneix B, Behr JProcNatlAcadSci USA 1995;92:7297-7301.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 13:04
Nur für Besitzer und Autoren: Kontrollseite des Eintrags
Downloadstatistik