| License: Publishing license for publications excluding print on demand (1MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-6832
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.10447
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 27 July 2006 |
| Referee: | Ralf (Prof. Dr.) Wagner |
| Date of exam: | 11 July 2006 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie |
| Keywords: | HIV , HIV-Infektion , Gentherapie , Replikation , Gentransfer , Gentherapie , T-Lymphozyt , transdominant negativ , HIV , replication , genetherapy , Gag , transdominant negative |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 10447 |
Abstract (German)
Die genetische Modifikation von T-Lymphozyten zum Schutz vor der Infektion der Zellen bietet eine alternative Behandlungsform von HIV+ Patienten zur HAART. Die Expression eines entry-Inhibitors erbringt transduzierten Zellen unter dem Druck einer Infektion einen selektiven Vorteil. Jedoch kann nicht ausgeschlossen werden, dass gegen den Inhibitor resistente Viren auftreten. Um diesen resistenten ...
Abstract (German)
Die genetische Modifikation von T-Lymphozyten zum Schutz vor der Infektion der Zellen bietet eine alternative Behandlungsform von HIV+ Patienten zur HAART. Die Expression eines entry-Inhibitors erbringt transduzierten Zellen unter dem Druck einer Infektion einen selektiven Vorteil. Jedoch kann nicht ausgeschlossen werden, dass gegen den Inhibitor resistente Viren auftreten. Um diesen resistenten HIV-Varianten keine Möglichkeit zur Ausbreitung im Patienten zu geben, müssen die Zellen mit einem zweiten anti-HIV-Gen ausgestattet werden. Mathematische Berechnungen haben gezeigt, dass die Kombination aus einem Inhibitor der frühen Replikationsphase und einem Hemmer der späten Replikationsphase die beste Verbindung ist. Transdominante HIV-1 Gag-Mutanten sind starke Inhibitoren der späten Phase der HIV-Replikation, indem sie mit dem Zusammenbau der Virionen und deren Freisetzung interferieren. Das Ziel dieser Arbeit war es, transdominante Gag-Varianten herzustellen und deren Wirksamkeit zu testen. Besonders wichtig war hierbei die Immunogenität der Gag-Varianten, die für die in vivo Applikation in HIV+-Patienten eine entscheidende Rolle spielt, da im Patienten T-Zellen, die das starke Antigen Gag exprimieren, von spezifischen CTL erkannt und lysiert werden.
Ausgehend von einer kodonoptimierten, transdominanten Gag-Variante (TDsyngag) sollten zunächst Derivate erstellt werden, die erst transkribiert bzw. exprimiert werden, wenn die dafür nötigen regulatorischen Proteine in Folge einer Infektion mit dem HI-Virus vorhanden sind. Die Untersuchungen ergaben, dass die Konstrukte, die Rev-induzierbar bzw. konstitutiv exprimiert werden, die Replikation von HIV in Zellkultur am effektivsten reduzierten. Die Tat- und die Tat/Rev-induzierbare Strategie zeigte jedoch keine antivirale Wirkung.
Zudem wurde eine Region im p24CA deletiert, die besonders viele CTL-Epitope aufweist, was die Immunogenität der Konstrukte reduzieren sollte. Durch die Einführung dieser Deletion verloren die Konstrukte nicht an inhibitorischer Kapazität. Da jedoch ein Rev-induzierbares Wildtyp-Konstrukt den Sicherheitsansprüchen einer Gentherapie durch die Möglichkeit der Rekombination mit HIV nicht entspricht, wurde diese Strategie nicht weiter verfolgt.
Die Fusion der konstitutiv exprimierten TDGag-Varianten mit einem immunsuppressiven GA-Bereich sollte die in vivo Anwendung möglich machen. Der GA-Bereich erhöht die Stabilität von TDGag, indem die Degradation durch das Proteasom blockiert wird. Die erhöhten Proteinmengen, die auf Grund des fehlenden Abbaus entstehen, führen zu gesteigerter Inhibition der HIV-1-Replikation. Des Weiteren werden keine Antigenpeptide über MHC Klasse-I präsentiert und somit sind die Zellen im Mausmodell in vitro und in vivo vor der Lyse durch CTL geschützt. Zur weiteren Optimierung der transdominanten Mutanten wurden die minimalen Bereiche von Gag (Minigag), die noch zur Interaktion mit dem gesamten Protein fähig sind, als Effektoren verwendet. Hierbei konnten Konstrukte definiert werden, die eine starke inhibitorische Wirkung auf die Replikation von HIV in vitro haben, jedoch aufgrund ihrer Größe und der Verbindung mit dem suppressiven Linker GA sehr geringes immunologisches Potential haben. Zudem erwies sich ein Minigag-Konstrukt auch Tat-induzierbar als guter Inhibitor.
Es wurde zum einen mit dem immunsuppressiven Linker GA ein Werkzeug gefunden, dass es ermöglicht, potentiell immunogene Transgen-Produkte für gentherapeutische Zwecke zu verwenden. Zum anderen wurden mit den konstitutiv exprimierten TDsyngag-Varianten und den Minigag-Konstrukten Transgene entwickelt deren Anwendung durch ihre inhibitorische Wirkung auf die HIV-Replikation und ihrer immunologischen Eigenschaften potentiell möglich ist. Diese Konstrukte werden derzeit in Kombination mit einem Inhibitor der frühen Phase der HIV-Replikation in Affenstudien getestet � die Anwendung im Menschen wird bereits erwogen.
Translation of the abstract (English)
Gene therapy is a novel strategy against HIV/AIDS, which is promising regarding problems like toxicity and resistance of antiviral drug therapy. A deletion within the HIV-1 group specific antigen (Gag) confers transdominat negative (TD) properties resulting in inhibition of HIV-1 replication. In respect of gene therapy approaches using TDgag transduced T cells the major problem is the host immune ...
Translation of the abstract (English)
Gene therapy is a novel strategy against HIV/AIDS, which is promising regarding problems like toxicity and resistance of antiviral drug therapy. A deletion within the HIV-1 group specific antigen (Gag) confers transdominat negative (TD) properties resulting in inhibition of HIV-1 replication. In respect of gene therapy approaches using TDgag transduced T cells the major problem is the host immune response to the encoded transgene. Fusing a 24 aa long Glycine-Alanine (GA) stretch derived from EBNA-1 overcomes the proteasomal degradation of the resulting GATDsyngag protein and thereby its recognition by CD8+ T cells. Additionally, the GATDsyngag mutant interferes as efficient as the TDsyngag with replication of wildtype virus. Moreover, the GA stretch increases the GATDsyngag protein level and stability by blocking the proteasomal destruction of Gag. Thereby, it does not positively affect mRNA levels, in fact mRNA levels are decreased. The intramuscular immunisation of BALB/c mice with plasmid DNA coding for Gag and TDGag with and without GA resulted in the induction of a Gag-specific CTL response in the recipient mice. However, recognition of cells expressing the GA-transgene by CD8+ T cells was drastically reduced and inhibited, respectively.
A further approach to avoid T cell dependent lysis of transduced cells was the generation of HIV-1 inducible TDGag constructs. In addition, a further deletion to delete potentially immunogenic regions was introduced without affecting the transdominant negative properties. The expression of inducible transdominant negative derivatives was demonstrated to be dependent on HIV-1 regulatory proteins. In transient inhibition tests all generated variants were highly active against HIV-1, whereas in stable transduced cell lines only the Rev-dependent and the constitutive expressed TDGag showed a strong interference with HIV-1 replication. This approach enables the generation of efficient gene therapy candidates exhibiting improved properties against HIV-1 replication and reduced potential immunogenicity. Furthermore, we developed Gag-derived transdominant constructs (TDminigag) that are able to inhibit HIV-1 replication, thereby inducing only minimal cellular immune responses. In addition, Tat-inducible constructs were produced to increase the overall safety and efficacy. HIV-1 replication was significantly reduced in PM1 cells transduced with retroviral vectors containing TDminigags. Furthermore, the TDminigags showed dramatically reduced CTL responses compared to full length gag constructs. Results from this study support the rational to use transdominat Gag-derivatives as potential tools for HIV-1 specific gene therapy approaches.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 12:59
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