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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-7012
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.10470
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 12 Oktober 2006 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Thomas (PD Dr.) Dobner |
| Tag der Prüfung: | 27 April 2006 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin |
| Stichwörter / Keywords: | Adenovirus 5 , Maligne Transformation , Protein p53 , Genregulation , E1B-55K , NES , PML-NBs , Mre11 , E1B-55K , NES , PML-NBs , Mre11 |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 10470 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Das 55-kDa Genprodukt der frühen Region 1B (E1B-55K) von Adenovirus Serotyp 5 (Ad5) ist ein multifunktionelles Phosphoprotein, das eine zentrale Rolle im Ad5-vermittelten Transformationsvorgang primärer Zellen einnimmt. Den onkogenen Aktivitäten des E1B-Proteins liegen verschiedene Wirkmechanismen zugrunde. An erster Stelle steht dabei die Inaktivierung des zellulären Tumorsuppressorproteins p53 ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Das 55-kDa Genprodukt der frühen Region 1B (E1B-55K) von Adenovirus Serotyp 5 (Ad5) ist ein multifunktionelles Phosphoprotein, das eine zentrale Rolle im Ad5-vermittelten Transformationsvorgang primärer Zellen einnimmt. Den onkogenen Aktivitäten des E1B-Proteins liegen verschiedene Wirkmechanismen zugrunde. An erster Stelle steht dabei die Inaktivierung des zellulären Tumorsuppressorproteins p53 auf der Ebene der Transkription. Als weitere Faktoren werden schon seit längerem eine intrinsische Kernexportaktivität und posttranslationale Funktionen vermutet, die über unterschiedliche Bereiche im viralen Polypeptid reguliert werden. Soweit bekannt, handelt es sich dabei um ein Leucin-reiches Kernexportsignal (NES) sowie um zwei hoch konservierte Sequenzmotive, die große Übereinstimmung zu sog. BC-Boxen oder atypischen RING-Fingerdomänen aufweisen.
Vor dem Hintergrund dieser Beobachtungen wurden in der vorliegenden Arbeit weiterführende Untersuchungen zur Funktion des NES, der BC-Box und der RING-Fingerdomäne im E1B-55K-induzierten Transformationsvorgang durchgeführt. Im Mittelpunkt der Arbeiten standen verschiedene Mutanten des E1B-Proteins, die definierte Aminosäureaustausche in den entsprechenden Sequenzmotiven enthalten. Durch klassische Transformationsexperimente auf der Basis primärer Rattenepithelzellen gelang zunächst der Nachweis, dass die Kernexportfunktion des E1B-Proteins für seine transformierenden und onkogenen Eigenschaften nicht essenziell ist. Vielmehr zeigen die erzielten Ergebnisse, dass die Inhibition des Kernexportvorgangs die Transformationsrate und Tumorigenität der transformierten Zellen deutlich steigert. Die erhöhte Focus-Bildung und Tumorigenität der Zellen korreliert mit einem signifikanten Anstieg der E1B-vermittelten Repression p53-stimulierter Transkription, der vollständigen Umverteilung von p53 und PML-NB-Kerndomänen in große Proteinaggregate und der Bindung von E1B-55K an die PML-NB-Komponenten daxx und PML. Diese Beobachtungen zeigen erstmalig, dass die Wechselwirkung von E1B-55K mit daxx und PML und die damit verbundene Modulation der PML-NB-Kerndomänen einen wichtigen Schritt in E1B-induzierten Transformationsprozess darstellen.
Diese Annahme wird durch die Untersuchungen zur Funktion der BC-Box und RING-Fingerdomäne unterstützt. Die Ergebnisse dieser Versuche zeigen, dass bestimmte Aminosäureaustausche in der BC-Box (E1B-BC1) oder in der RING-Fingerdomäne (E1B-RF6) die Transformationsrate deutlich reduzieren. Dabei korreliert der Phänotyp der BC1-Mutante mit dem Verlust der Inhibition p53-stimulierter Transkription in Reportergenanalysen. Im Gegensatz dazu wird die Repression von p53 durch die Mutationen in E1B-RF6 kaum beeinträchtigt. Dieser Befund ist hoch interessant, da er erstmals eine p53-unabhängige Funktion des E1B-Proteins im Ad5-vermittelten Transformationsprozess aufzeigt. Auf molekularer Ebene wird diese Aktivität höchstwahrscheinlich über die Wechselwirkung mit dem zellulären PML-NB-assoziierten Protein Mre11 vermittelt, das bekanntermaßen eine zentrale Rolle in der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen spielt. Interessanterweise verhindern die Mutationen in E1B-RF6 neben der Bindung an Mre11 auch die Umverteilung von PML-NBs und p53 in subnukleäre Proteinaggregate. Dies lässt vermuten, dass E1B-55K die Funktion und Lokalisation von PML-NBs bzw. PML-NB-assoziierten Komponenten über die Bindung an Mre11 moduliert. Ob und in welchem Umfang E1B-55K dabei die Mre11-regulierten Prozesse der DNA-Reparatur und Telomer-Erhaltung verändert, ist noch unklar. Erste Untersuchungen in diese Richtung weisen jedoch darauf hin, dass möglicherweise eine Funktion von Mre11 verändert wird, die im Zusammenhang mit der Zellzykluskontrolle bei G2/M-Phasenübergang stehen könnte.
Im Ganzen zeigen diese Ergebnisse dieser Arbeit erstmals, dass Ad5 E1B-55K über p53-abhängige und -unabhängige Mechanismen zur vollständigen Transformation primärer Zellen beiträgt. Letztere Aktivität wird zumindest teilweise über die Wechselwirkung mit Mre11 und über die Modulation von PML-NBs bzw. den PML-NB-assoziierten Komponenten daxx und PML reguliert. Da alle bislang untersuchten DNA- und RNA-Tumorviren Genprodukte besitzen, die die Integrität von PML-NBs verändern, könnte die Bindung an Mre11 und die Mre11-abhängige Modulation von PML-NBs durch E1B-55K einen allgemein gültigen Mechanismus virusinduzierter Onkogenese darstellen.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
The 55K product from adenovirus type 5 (Ad5) early region 1B (E1B-55K) belongs to a group of adenoviral regulatory proteins that are individually capable of cooperating with Ad early region 1A (E1A) to oncogenically transform primary rodent cells in culture. A large body of evidence indicates that the transforming potential of Ad5 E1B-55K correlates with its ability to act as a direct ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
The 55K product from adenovirus type 5 (Ad5) early region 1B (E1B-55K) belongs to a group of adenoviral regulatory proteins that are individually capable of cooperating with Ad early region 1A (E1A) to oncogenically transform primary rodent cells in culture. A large body of evidence indicates that the transforming potential of Ad5 E1B-55K correlates with its ability to act as a direct transcriptional repressor targeted to p53-responsive promoters by binding to the tumor suppressor protein. In addition more recent data suggest that the mode of action of the Ad protein during transformation may involve additional functions and other protein interactions. These may include continuous nucleocytoplasmic shuttling via a leucine-rich nuclear export signal (NES), a predicted elongin B and C binding domain (BC-box), an atypical RING finger motif and several clustered histidine and cysteine residues some of which are conserved in E1B-55K proteins from human subgroup A to F adenoviruses.
To evaluate the significance of these domains on Ad5 E1B-55K transforming functions we tested a panel of mutants containing single- or double-amino acid substitutions. These studies demonstrate that an export-deficient mutant of the viral protein (E1B-NES) substantially enhances focus formation of primary baby rat kidney (BRK) cells in combination with Ad E1A. Transformed rat cells stably expressing the E1B-NES protein exhibited increased tumorigenicity and accelerated tumor growth in nude mice compared to transformants containing the wild-type E1B product. This �gain of function� correlated with enhanced inhibition of p53 transactivation in transient reporter assays and the accumulation of the mutant protein and p53 in several dot-like subnuclear aggregates. Interestingly, these structures also contained a large fraction of cellular PML and daxx, two known regulators of p53. These data indicate that E1B-NES promotes oncogenic transformation by combinatorial mechanisms that involve modulation of p53 in the context of PML-NBs. Consistent with this model we found that E1B-55K can bind to PML and daxx.
Further support for this idea comes from the finding that two amino acid substitutions (C454S/C456S) created a 55K mutant protein which was substantially reduced in transforming activity. Interestingly, the same mutations did neither affect binding to p53 nor inhibition of p53-mediated transactivation. Therefore, an activity necessary for efficient transformation of primary rat cells can be separated from functions required for inhibition of p53-stimulated transcription. Our data indicate that this activity is linked to the ability of the Ad5 protein to bind to Mre11, a central component of the Mre11/Rad50/NBS1 DNA double-strand break repair complex, and/or its ability to assemble multiprotein aggregates in the cytoplasm and nucleus of transformed rat cells. These results introduce a new function for Ad5 E1B-55K and suggest that the viral protein contributes to cell transformation through p53 transcription-dependent and -independent pathways. More significantly, since all DNA- and RNA-tumor viruses tested so far possess gene products which alter the integrity of PML-NBs, the interaction with Mre11 and the Mre11-dependent modulation of the PML-NBs by E1B-55K could represent a general mechanism of virus induced oncogenesis.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 12:57
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