| License: Publishing license for publications excluding print on demand (8MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-7266
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.10514
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 18 July 2007 |
| Referee: | Achim (Prof. Dr.) Göpferich |
| Date of exam: | 14 November 2006 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical Technology (Prof. Göpferich) |
| Keywords: | Arzneistoffträger , Triglyceride , Kontrollierte Wirkstofffreisetzung , Proteine , Lipidmatrix , Protein , Kontrollierte Freigabe , Konfokale Mikroskopie , Freisetzungsmechanismus , Lipid matrix , protein , controlled release , confocal microscopy , release mechanism |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 10514 |
Abstract (English)
In recent years, we have seen significant progress towards understanding the role of proteins in both physiological and pathological processes. Especially neurotrophic factors have increasingly come into focus for the treatment of neurodegenerative diseases, however still no satisfying delivery strategies for long-term applications have been established. Most proteins possess a hydrophilic ...
Abstract (English)
In recent years, we have seen significant progress towards understanding the role of proteins in both physiological and pathological processes. Especially neurotrophic factors have increasingly come into focus for the treatment of neurodegenerative diseases, however still no satisfying delivery strategies for long-term applications have been established. Most proteins possess a hydrophilic character and can therefore be retarded by encapsulation into more hydrophobic matrix materials.
It was the aim of this thesis to establish physiological triglyceride matrices as a suitable alternative to commonly used polymeric carriers for the long-term controlled release of protein drugs. The success in comprehensively achieving this goal was to a great extent based on the parallel investigation into both mechanistic and application based aspects. Visualization of internal processes inside the matrices at all stages by confocal microscopy played a major role in advancing both fields of work and thoroughly understanding the system.
First, in a comparison with the so far used manufacturing methods, PEG co lyophilization was developed as a new strategy with superior performance in finely and homogenously distributing lysozyme as a model protein in lipid matrix material with complete retention of activity. The method was designed as a one-pot procedure, where protein was micronized in a first step due to freezing�induced aqueous phase separation in the presence of PEG, and then dispersed in the solid state in a solution of the lipid in an organic solvent. Confocal microscopy pointed to the fine and homogenous distribution being the crucial prerequisite for long-term delivery. With this, a reduction in matrix size to dimensions of 1mm diameter and 1mm height was feasible, for the first time enabling their investigation in the animal brain, where they showed excellent biocompatibility. BDNF and IL-18 were incorporated by this method into glyceryl tripalmitate under complete retention of activity as demonstrated by BDNF-ELISA and a cell based IL 18 bioassay.
A thorough understanding of the mechanisms underlying release from a drug delivery device is crucial for developing strategies to tailor the release profile and being able to react to drug stability problems. It could be demonstrated by diffusion studies of fluorescently labelled BSA, excipient PEG and release buffer visualized with the help of confocal microscopy that buffer could only penetrate into the matrices, where excipient or protein starts to dissolve and diffuses out. A linear concentration gradient of diffusing protein was formed between a buffer penetration front and the matrix surface until the buffer reached the centre of the device. The power law was an adequate mathematical model for the description of release profiles of FITC-BSA and lysozyme at loadings between 1 and 8%, with data being linear to time0.45 for up to 60% cumulative release. At 3-5% protein loading, a percolation threshold could be identified, predicting the loading, above which complete release of the matrices is possible due to the formation of a continuous network of pores.
Buffer penetration and drug diffusion, the two crucial mechanisms for release identified by confocal microscopy, were further investigated for their dependence on matrix and drug properties. It could be demonstrated, that wettability of the matrix governed the buffer penetration velocity. This could be employed to tailor the release profile in a time range of more than 14months by varying matrix lipophilicity through changing the chain length of the fatty acid in the triglyceride. However, this was only possible when the incorporated drug was a protein, being able to reduce buffer contact angles via its own surface active properties. Non-surface active model substances, such as FITC-dextrans remained trapped within the triglyceride, due to their inability to induce wetting and buffer penetration. This, however, could be triggered by the addition of the surfactants Tween®20 and 81 at time points up to 57days after initial incubation, leading to a complete release of the matrix loading.
Apart from drug surface activity, another important characteristic was its molecular weight, being decisive for the diffusion step during release. An impact could be proven not only for seven different model proteins (lysozyme, trypsin, ovalbumin, BSA, ADH, catalase, thyroglobulin) but also for FITC-dextrans of different molecular weights in the presence of surfactant in the release buffer.
As a conclusion, with the work described in this thesis, lipid matrices could be established as a controlled release systems for long-term delivery of protein drugs. Concomitantly, it presents a fundamental insight into both release mechanisms and potential applications. It thus can provide a basis for a better understanding also for other kinds of matrix geometries and lipophilic materials, for which diffusion is the major release controlling factor.
Translation of the abstract (German)
Im Verständnis der Rolle von Proteinen sowohl bei physiologischen als auch pathologischen Abläufen wurden in den vergangenen Jahren entscheidende Fortschritte erzielt. Besonders neurotrophe Faktoren erscheinen vielversprechend für die Therapie von neurodegenerativen Erkrankungen, jedoch existiert bisher noch keine geeignete Strategie für die Verabreichug über einen längeren Zeitraum hinweg. Die ...
Translation of the abstract (German)
Im Verständnis der Rolle von Proteinen sowohl bei physiologischen als auch pathologischen Abläufen wurden in den vergangenen Jahren entscheidende Fortschritte erzielt. Besonders neurotrophe Faktoren erscheinen vielversprechend für die Therapie von neurodegenerativen Erkrankungen, jedoch existiert bisher noch keine geeignete Strategie für die Verabreichug über einen längeren Zeitraum hinweg. Die meisten Proteine haben hydrophilen Charakter und könnten deshalb zur Verzögerung ihrer Freisetzung in hydrophobe Matrixmaterialien eingebettet werden.
Das Ziel dieser Doktorarbeit war es, physiologische Triglycerid-Matrizes als geeignete Alternative zu herkömmlichen Polymermaterialien für die kontrollierte Langzeit-Freigabe von Proteinarzneistoffen zu etablieren. Die erfolgreiche Umsetzung dieses Ziels beruht auf einer parallelen Untersuchung von sowohl mechanistischen als auch anwendungsorientierten Aspekten. Die Visualisierung von Prozessen im Inneren der Matrizes durch Konfokale Mikroskopie spielte eine entscheidenden Rolle dabei, beide Untersuchungsgebiete voranzutreiben und das Freigabesystem umfassend zu verstehen.
In einem ersten Schritt wurden die bisher bekannten Herstellungsmethoden mit der neu entwickelten PEG Co-Lyophilisierungstechnik verglichen. Diese war eindeutig darin überlegen, eine feine und homogene Verteilung des Modellproteins Lysozym im Lipidmatrixmaterial unter vollständiger Konservierung der Proteinaktivität sicherzustellen. Dabei wird zunächst Protein im Zuge einer Gefrier-induzierten Phasentrennung in Gegenwart von PEG mikronisiert und dann im selben Gefäß als Feststoff in einer organischen Lipidlösung dispergiert.
Die Ergebnisse der Konfokalen Mikroskopie legten nahe, dass die feine Verteilung die entscheidende Voraussetzung für die Langzeit-Freigabe ist. Dadurch konnte eine Größenreduktion auf 1mm Durchmesser und 1mm Höhe verwirklicht werden, was erstmals eine Untersuchung der Matrizes im Tierhirn ermöglichte, wo sie hervorragende Biokompatibilität zeigten. Mit dieser Methode wurden sowohl BDNF als auch IL-18 unter vollständigem Erhalt der Aktivität eingebettet, was durch BDNF-ELISA und einen Zellkultur-basierten IL-18 Bioassay belegt werden konnte.
Ein umfassendes Verständnis des Freisetzungsmechanismus ist entscheidend für die Entwicklung von Strategien zur Dosisanpassung und um auf Stabilitätsprobleme reagieren zu können.
Durch Diffusionsstudien mit fluoreszenzmarkierten BSA, PEG und Freisetzungspuffer konnte am Konfokalen Mikroskop gezeigt werden, dass Puffer nur dort in die Matrizes eindringen kann, wo Hilfsstoff oder Protein aufgelöst werden und ausdiffundieren. Dabei entsteht ein linearer Protein-Konzentrationsgradient zwischen der eindringenden Pufferfront und der Matrixoberfläche, solange bis der Puffer das Zentrum des Zylinders erreicht. Das "power law" erwies sich als adäquates mathematisches Modell, um Freisetzungsprofile von FITC-BSA und Lysozym zwischen 1 und 8% Beladung zu beschreiben, wobei bis 60% Freisetzung ein linearer Zusammenhang zu Zeit0.45 beobachtet wurde. Zwischen 3-5% Protein-Beladung konnte ein Perkolations-Schwellenwert identifiziert werden, der für die Beladung steht, ab der durch die Bildung eines kontinuierlichen Porennetzwerks eine vollständige Freisetzung aus der Matrix möglich ist.
Für die zwei entscheidenden Mechanismen der Freisetzung, Eindringen von Puffer und Ausdiffusion der Modellsubstanzen, wurde weiter untersucht, inwiefern sie von Matrix- und Substanzeigenschaften abhängen.
Es konnte gezeigt werden, dass die Matrixbenetzbarkeit die Eindringgeschwindigkeit des Puffers steuert. Dies konnte genutzt werden, um das Freisetzungsprofil in einem Rahmen von 14 Monaten anzupassen, indem die Matrixlipophilie durch die Wahl unterschiedlicher Fettsäurekettenlängen gesteuert wurde. Allerdings war dies nur möglich, wenn es sich bei der Modellsubstanz um ein Protein handelte, das durch seine eigene Oberflächenaktivität befähigt ist, den Puffer-Kontaktwinkel herabzusetzen. Nicht-oberflächenaktive Substanzen wie beispielsweise FITC-Dextrane bleiben im Triglycerid eingeschlossen, da sie weder Benetzung noch Eindringen des Puffers induzieren können. Eine komplette Freisetzung dieser Substanzen konnte erzielt werden, indem dem Freisetzungspuffer bis zu 57 Tagen nach Inkubationsbeginn die Tenside Tween®20 und 81 zugesetzt wurden.
Außer der Oberflächenaktivität einer Modellsubstanz erwies sich das Molekulargewicht als entscheidende Einflussgröße für den Diffusionsschritt während der Freisetzung. Sowohl für 7 verschiedene Modellproteine (Lysozyme, Trypsin, Ovalbumin, BSA, ADH, Catalase, Thyroglobulin) als auch für FITC-Dextrane in Gegenwart von Tensid konnte ein Einfluss nachgewiesen werden.
Zusammenfassend tragen die Ergebnisse dieser Doktorarbeit entscheidend dazu bei, Lipidmatrizes als Langzeit-Freigabesystem zur kontrollierten Verabreichung von Proteinarzneistoffen zu etablieren. Gleichzeitig wird sowohl in Freisetzungsmechanismen als auch potentielle Anwendungsgebiete ein grundlegender Einblick gegeben, und auch für andere diffusionsgesteuerte lipophile Materialien und Matrixgeometrien die Basis für ein besseres Verständnis gelegt.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 12:51
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