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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-8493
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.10582
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 7 October 2007 |
| Referee: | Rainer (Prof. Dr.) Köster |
| Date of exam: | 20 September 2007 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik |
| Keywords: | Immobilisierung , Zirkulardichroismus , Immobilisiertes Enzym , Emulsionspolymerisation , Sekundärstruktur , Magnetteilchen , Penicillin-G-Acylase , Penicillin G Acylase , penicillin G acylase |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 10582 |
Abstract (German)
In dieser Arbeit wurde die Immobilisierung des Modellenzyms Penicillin G Acylase (EC 3.5.1.11) von E.coli untersucht. Sowohl die Beladung als auch die spezifische Aktivität des Enzyms wurde durch Optimierungen verbessert. Durch Circulardichroismus-Messungen wurde die Sekundärstruktur des immobilisierten Enzyms bestimmt. Synthese der Polymerpartikel Es wurden nicht-poröse magnetische ...
Abstract (German)
In dieser Arbeit wurde die Immobilisierung des Modellenzyms Penicillin G Acylase (EC 3.5.1.11) von E.coli untersucht. Sowohl die Beladung als auch die spezifische Aktivität des Enzyms wurde durch Optimierungen verbessert. Durch Circulardichroismus-Messungen wurde die Sekundärstruktur des immobilisierten Enzyms bestimmt.
Synthese der Polymerpartikel
Es wurden nicht-poröse magnetische Polymerpartikel erhalten, die über eine hohe mechanische Stabilität verfügen und in organischen Lösungsmitteln, sowie wässrigen Systemen von pH 3.5 bis 12 stabil sind. Diese können in wässrigen Medien zwei Jahre lang gelagert werden. Sie weisen eine hohe magnetische Sättigung auf, die eine magnetische Separierung ermöglicht und stellen 500 µmol/g Oberflächengruppen für die Funktionalisierung durch Spacer zur Verfügung. Der mittlere Teilchendurchmesser lag unter 5 µm und die spezifische Oberfläche im Bereich von ~ 2 bis ~ 5 m2/g. Die Polymethylacrylat-Partikel verfügten über ein Zetapotential bei pH 7.5 von -28 mV und die Polyvinylacetat-Partikel von +3.4 mV.
Daraus ergeben sich Träger, die hervorragend für die Immobilisierung geeignet sind, da sie preisgünstig (< 10 �/g), leicht separierbar und stabil sind, sowie eine hohe Beladung ermöglichen. Auf Grund der geringen Größe der Partikel entstehen keine hohen Diffusionslimitierungen.
Funktionalisierung mit Spacern
Die Polymerpartikel wurden mit Hexamethylendiamin aktiviert und mit zwei verschiedenen Spacern funktionalisiert. Der erste Spacer (Hexamethylendiamin-Glutardialdehyd-Spacer, HG-Spacer) besteht aus einer Abfolge von Hexamethylendiamin und Glutardialdehyd, der zweite Spacer (Aminosäurespacer, AS-Spacer) besteht aus Aminosäuren. Die Längenvariation (bezogen auf ideal linearisierte Spacermoleküle) des HG-Spacers umfasste einen weiten Bereich (14.6 nm). Die Verwendung von Spacern mit variablen Aminosäuren stellt einen neuartigen Ansatz dar, der auf Grund der Vielzahl von Aminosäuren mit unterschiedlicher Seitenkette eine hohe Variabilität der Struktur ermöglicht.
Die verwendete Immobilisierungsmethode mittels Glutardialdehyd erlaubt Arbeiten in wässrigen Medien (kein Lösungsmittelaustausch), besaß eine hohe Ausbeute und ist preiswert. Diese Methode wurde zudem durch Variation der Reaktionsparameter weiter verbessert.
Der HG-Spacer wurde in seiner Länge von 1.62 bis 16.2 nm variiert und das Enzym Penicillin G Acylase (EC 3.5.1.11 von E.coli) immobilisiert. Dabei ergab sich, dass eine maximale spezifische Aktivität von 42.2 U/mg (U = Unit [µmol/min], freies Enzym: 42.0 mg/g bei gleichem Aktivitätstest) bei einer Menge von 24.0 mg/g aktivem Enzym auf den Partikeln erreicht wurde.
Der AS-Spacer wurde in seiner Länge von 2.9 bis 9.1 nm und durch die Verwendung von verschiedenen Aminosäuren (alpha-Aminobutylsäure, Asparaginsäure, Glycin, Lysin, Phenylalanin und Prolin) modifiziert. Die maximale Beladung wurde mittels des reinen Lysinspacers mit 60.5 mg/g erreicht (5.3 nm), während die maximale Menge an aktivem Enzym beim Phenylalaninspacer mit 19.1 U/mg bei 2.9 nm erreicht wurde.
Aufklärung der Sekundärstruktur
Die Penicillin G Acylase wurde durch eine 1D-Gelelektrophorese aufgetrennt und gereinigt, durch Trypsin in Peptidfragmente abgebaut und mittels Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS/MS) charakterisiert (Proteindatenbank-Eintrag 1h2g, molare Masse 86192 g/mol). Anschließend wurden die Partikel (Silica-Nanopartikel, Ludox®-HS40 von Grace Davison) mit Glutardialdehyd funktionalisiert und das Enzym kovalent daran gebunden. Dabei wurde die Beladung bis zur Sättigung (55.8 mg/g) erhöht, die Ausbeute sank dabei aber auf 14%.
Die kovalente Immobilisierung des Enzyms auf diesen Silica-Nanopartikeln (12 nm Durchmesser, monodispers) änderte die Struktur des Enzyms nur sehr gering: Der mit Circulardichroismus-Messungen bestimmte Anteil an alpha-Helices stieg um 0.5%, der Anteil der beta-Faltblätter um 2.2%, dafür sank der Anteil der beta-Schleifen um 1.6% und der des ungeordnete Strukturanteils um 1.1%. Die spezifische Aktivität sank allerdings mit zunehmender Beladung rapide: Von 22.1 bis 9.17 U/mg.
Screening-Methode für Immobilisierungen
Es wurden vergleichende Messungen im µl-Maßstab zur Kinetik von Enzymimmobilisierungen an Oberflächen und erzielbare maximale Beladung erstmalig mit der Quarzkristallmikrowaagen-Technik durchgeführt. Die Methode stellt wegen der geringen benötigten Mengen eine ideale Screening-Methode im Vergleich zu klassischen Synthesemethoden und biochemischen Charakterisierungsverfahren (wie Hydrolyse eines Substrates) dar.
Translation of the abstract (English)
Immobilisation of the model enzyme penicillin G acylase (EC 3.5.1.11) from E. coli was investigated. Both loading and specific activity of the enzyme were improved by optimisation. The secondary structure of the immobilised enzyme was determined by circular dichroism measurements. Synthesis of the polymer particle Non-porous magnetic polymer particles were obtained, which had a high mechanical ...
Translation of the abstract (English)
Immobilisation of the model enzyme penicillin G acylase (EC 3.5.1.11) from E. coli was investigated. Both loading and specific activity of the enzyme were improved by optimisation. The secondary structure of the immobilised enzyme was determined by circular dichroism measurements.
Synthesis of the polymer particle
Non-porous magnetic polymer particles were obtained, which had a high mechanical stability and were stable in organic solvents and water-based media at a pH of 3.5 to 12. The particles could be stored in water-based media for two years. They had a high magnetic saturation which allowed for magnetic separation and provided 500 µmol/g of functional groups for further modifications with a spacer. The average particle diameter was below 5 µm and the specific surface was in the range of 2 to 5 m2/g. The polymethylacrylate particle had a zeta potential of -28 mV, whereas that of the polyvinylacetate particle amounted to +3.4 mV.
The particles obtained were found to be very useful for enzyme immobilisation, because they are cheap (< 10 �/g), easy to separate and stable, and allow for high loading. Due to the small particle size, no strong diffusion limitation will occur.
Modification with a spacer
The polymer particles were activated with hexamethylenediamine and further modified with two different spacers. The first spacer (hexamethylenediamine-glutardialdehyde spacer, HG spacer) consisted of a continuous sequence of hexamethylenediamine and glutardialdehyde; the second spacer (amino acid spacer, AS spacer) contained amino acids. The spacer length (related to the ideal stretched spacer molecules) of the HG spacer was varied over a wide range (14.6 nm). Use of a spacer with variable amino acids represented a new approach which ensured a high variability of the structure because of the high amount of different structured amino acids.
The glutardialdehyde method allowed for work in water-based media (no solvent exchange is necessary), reached a high yield, and costs were low. This method was further improved by varying the reaction parameters.
The HG spacer was modified in its length from 1.62 to 16.2 nm and the enzyme penicillin G acylase (EC 3.5.1.11, from E. coli) was immobilised. A maximum specific activity of 42.2 U/mg (unit = 1 µmol/min, free enzyme 42 U/mg, same activity test) was achieved for 24.0 mg/g active enzyme on the particles.
The AS spacer was modified in length from 2.9 to 9.1 nm and in structure through the use of different amino acids (alpha-aminobutylic acid, asparaginic acid, glycine, lysine, phenylalanine, and proline). Maximum enzyme loading was achieved with the pure lysine spacer (60.5 mg/g at 5.3 nm). The maximum amount of active enzyme was reached by the phenylalanine spacer with 19.1 U/mg at 2.9 nm.
Determination of the secondary structure
First, the enzyme was separated and purified by one-dimensional gel electrophoresis, reduced to peptide fragments with trypsine, and characterised with mass spectrometry (MALDI-TOF MS/MS). The protein database entry is 1h2g; the molar mass is 86192 g/mol. After that, the particles were modified with glutardialdehyde and the penicillin G acylase was covalently immobilised onto the particles (silica nanoparticles, Ludox®-HS40 from Grace Davison). Saturation was reached at 55.8 mg/g, but the yield dropped to 14% only.
Covalent immobilisation of the enzyme onto the silica nanoparticles (12 nm diameter, monodisperse) changed the enzyme structure only slightly: The amount of alpha-helix determined by circular dichroism increased by 0.5%, the amount of beta-sheets by 2.2%, while the amount of beta-turns decreased by 1.6% and the amount of random coils by 1.1%. Specific activity decreased strongly with increasing enzyme loading, from 22.1 to 9.17 U/mg.
Screening method for immobilisation
Comparative measurements of the kinetics of enzyme immobilisation on surfaces and the maximum enzyme loading achievable were made for the first time on the µl scale by means of the quartz crystal micro balance (QCM) technique. This method was compared to the standard synthesis and biochemical characterisation techniques (hydrolyses of a substrate) and found to be an ideal screening method because of the small amounts needed.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 12:42
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