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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-8813
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.10609
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 13 December 2007 |
| Referee: | Ralf (Prof. Dr.) Stanewsky |
| Date of exam: | 11 September 2007 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Zoologie |
| Keywords: | Taufliege , Biologische Uhr , Temperaturkompensation , Tagesrhythmus , Molekularer Schalter, Genregulation , Innere Uhr , Drosophila , circadian clock , period , timeless , temperature compensation |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 590 Zoological sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 10609 |
Abstract (German)
In der vorliegenden Dissertation wurden zwei Projekte bearbeitet, die sich mit den Faktoren period (per ) und timeless (tim) des molekularen Oszillators der inneren Uhr von Drosophila melanogaster, beschäftigen. Beide Gene arbeiten in einer negativen Rückkopplungsschleife zusammen und fungieren als Repressoren ihrer eigenen Transkription. Beide Proteine sind jedoch auch an der Verarbeitung ...
Abstract (German)
In der vorliegenden Dissertation wurden zwei Projekte bearbeitet, die sich mit den Faktoren period (per ) und timeless (tim) des molekularen Oszillators der inneren Uhr von Drosophila melanogaster, beschäftigen. Beide Gene arbeiten in einer negativen Rückkopplungsschleife zusammen und fungieren als Repressoren ihrer eigenen Transkription. Beide Proteine sind jedoch auch an der Verarbeitung äußerer Einflüsse im circadianen System beteiligt.
Das Protein TIM stellt eine Schnittstelle des molekularen Oszillators mit dem Mechanismus der Lichtrezeption dar. Eine Aktivierung des Photorezeptors CHRYPTOCHROME (CRY) durch Licht führt zu einem Abbau des Proteins TIM, wodurch die Synchronisation der inneren Uhr mit dem Zeitgeber Licht bewerkstelligt wird. Bereits vor 10 Jahren wurde anhand von Sequenzvergleichen gezeigt, dass es in der Natur zwei unterschiedliche tim-Allele gibt (s-tim und ls-tim), die theoretisch dazu in der Lage sind, zwei unterschiedlich lange TIM-Proteine zu bilden (Rosato et al., Nucleic Acids Res 25, 1997). Das Allel s-tim ist das ursprüngliche Allel und nur in der Lage das kurze S-TIM (1398 Aminosauren) zu bilden. ls-tim ist in Europa durch eine natürliche Mutation aus s-tim entstanden, kurz nachdem Drosophila aus Afrika eingewandert war. Es hat sich dann in Europa verbreitet, da es eine bessere Anpassung an die ausgeprägten jahreszeitlichen Schwankungen von Temperatur und Tageslänge vor allem in Nordeuropa bietet (Tauber et al., Science 316, 2007). Es wurde vermutet, dass es sowohl S-TIM, als auch das längere L-TIM (1421 Aminosäuren) exprimieren kann.
Durch Westernblotanalyse der Kopfextrakte verschiedener Fliegenlinien und Sequenzanalyse deren tim-Lokusse konnte gezeigt werden, dass zwei im Gel unterschiedlich schnell laufende TIM-Banden, auf die zwei tim-Allele zurückzuführen sind. Durch Wiederholung der Analysen mit und ohne Phosphatasebehandlung der Proteinextrakte konnte Phosphorylierung als Ursache für das unterschiedliche Laufverhalten der Proteine ausgeschlossen werden. Damit konnte gezeigt werden, dass das neue ls-tim-Allel tatsächlich ein längeres TIM exprimieren kann, als das ursprüngliche s-tim (Sandrelli et al., Science 316, 2007).
Das Protein PER ist, wie z.B. die Mutation perL (Konopka and Benzer, Proc Natl Acad Sci USA 68, 1971) oder Untersuchungen der T/G-Region in PER (Sawyer et al., Science 278, 1997) zeigen, unter Anderem auch maßgeblich an der Temperaturkompensation beteiligt, die dafur sorgt, dass sich die Periodenlänge der inneren Uhr nicht temperaturbedingt ändert. Altere Studien haben gezeigt, dass PER nicht nur einen Heterodimer mit TIM, sondern auch einen PER:PER-Homodimer bilden kann (Zeng et al., Nature 380, 1996). Da die Mutation in perL eine Homodimerisierung in vitro verhindert, wurde gefolgert, dass der PER:PER-Homodimer an der Temperaturkompensation beteiligt sein könnte (Huang et al., Science 267, 1995). Die Aufklärung der 3D-Struktur eines PER-Fragments schließlich ergab ebenfalls einen Homodimer und offenbarte zudem dessen Interaktionspunkte, was eine gezielte Untersuchung des Homodimers durch rekombinante Proteine ermöglichte (Yildiz et al., Molecular Cell 17, 2005).
Zur Untersuchung der Homodimerisierung von PER wurden daher in dieser Arbeit transgene Fliegenlinien erzeugt, die getagte PER-Proteine exprimieren. Ein Teil dieser Proteine trägt außerdem Aminosäureaustausche, die anhand der Strukturvorhersage eine Homodimerisierung verhindern. Durch Untersuchung des Lokomotorverhaltens der Transformanten, sowie der Expression und Dimerisierung der rekombinanten PER-Proteine, konnte eine Homodimerisierung klar nachgewiesen werden. Außerdem konnte eine Beteiligung am Mechanismus der Temperaturkompensation ausgeschlossen werden. Diese Untersuchungen geben zudem Grund zur Annahme, dass die Bindung von PER an TIM ein wesentlicher Baustein der Temperaturkompensation ist.
Der Vergleich der Aminosäuresequenz von PER mit PER-Proteinen der Maus zeigte, dass es auch im PER von Drosophila wahrscheinlich ein Nuclear Export Signal (NES) gibt (Vielhaber et al., J Biol Chem 276, 2001). per-Transformanten, die in diesem Exportsignal eine Mutation tragen, zeigten einen deutlichen Effekt in Bezug auf die zeitliche Kernlokalisation und auch die Temperaturkompensation der inneren Uhr. Dies ist ein guter Hinweis, dass es sich um ein funktionelles NES handelt und zeigt darüber hinaus, dass die zeitlich korrekte Lokalisation von PER einen weiteren wichtigen Bestandteil des Mechanismus der Temperaturkompensation darstellt.
Translation of the abstract (English)
In this dissertation two projects dealing with the factors period (per) and timeless (tim), which are important components of the molecular oscillator of the circadian clock of Drosophila melanogaster, have been approached. Both proteins are part of a negative feedback loop that represses their own transcription as well as the transcription of other genes that are under transcriptional control of ...
Translation of the abstract (English)
In this dissertation two projects dealing with the factors period (per) and timeless (tim), which are important components of the molecular oscillator of the circadian clock of Drosophila melanogaster, have been approached. Both proteins are part of a negative feedback loop that represses their own transcription as well as the transcription of other genes that are under transcriptional control of the circadian clock. Furthermore both genes are also involved in processing environmental influences in the circadian system.
The protein TIM is part of an interface that mediates the light input to the molecular oscillator. Activation of the photoreceptor CRYPTOCHROME (CRY) by light leads to the degradation of TIM, which synchronises the oscillator with the environmental day and night changes. Already 10 years ago the existence of two different tim alleles (s-tim and ls-tim) in wild type fly strains has been shown by sequence comparisons. These alleles are capable of expressing two different TIM isoforms in theory (Rosato et al., Nucleic Acids Res 25, 1997). The primal allele s-tim only is able to build a short form of TIM (S-TIM, 1398 amino acids). ls-tim evolved in Europe by mutation of s-tim after Drosophila invaded from Africa. It dispread over Europe, because it facilitates a better adaptation of the animal to the seasonal changes in temperature and day length, that occur especially in the northern parts of Europe (Tauber et al., Science 316, 2007). It has been suggested, that it can form the original short form (S-TIM) as well as a longer form (L-TIM, 1421 amino acids).
Western blot analysis of head extracts derived from different fly strains and sequence analysis of their tim loci indicated that the alleles show different TIM patterns according to the type of allele. Extracts of flies carrying s-tim only show one band on western blots, while extracts of ls-tim flies have an additional band derived from a slightly longer TIM protein. Via further tests with and without phosphatase treatment of the protein extracts, phosphorylation as a possible cause of the different patterns was excluded. Therefore it has been shown that the new allele ls-tim indeed is able to express both, the long and the short isoform of TIM (Sandrelli et al., Science 316, 2007).
Unlike normal chemical or biochemical reactions, the circadian clock is temperature compensated, which means it has the ability to keep the period of its oscillation constant over a wide range of temperatures. Studies of the mutation perL (Konopka and Benzer, Proc Natl Acad Sci USA 68, 1970) and the T/G repeat region of the PER protein (Sawyer et al., Science 278, 1997) pointed out, that PER, besides its function as a repressor, also plays a key role in the mechanism of temperature compensation. Several studies in the past showed that PER not only is able to form a PER:TIM hetero dimer but also a PER:PER homo dimer (Zeng et al., Nature 380, 1996). Because the mutation perL in vitro prevents the formation of an homo dimer, the PER:PER homo dimer had been suggested to be part of the mechanism underlying the temperature compensation (Huang et al., Science 267, 1995). Finally the solving of the three-dimensional structure of a PER fragment did not only again prove the homo dimerization but it also revealed the dimers points of interaction (Yildiz et al., Molecular Cell 17, 2005), which facilitated the targeted investigation of the PER:PER dimerization via recombinant proteins.
To assay the homo dimerization of PER, transgenic fly strains were created, that express tagged PER proteins. Furthermore, to investigate the dimers biological function, recombinant proteins carrying amino acid exchanges that, according to the three-dimensional structure, were supposed to block the homo dimerization, were expressed in flies. The molecular analysis of the expressed proteins again proved the homo dimerization and showed that this dimerization can be blocked by certain mutations. Furthermore the comparison of the locomotor behaviour at different temperatures of fly strains expressing PER proteins either able or unable to dimerize clearly showed, that the PER:PER homo dimer is not part of the mechanism underlying the temperature compensation.
The comparison of the amino acid sequences of Drosophila PER with the homologous proteins of mouse (mPER1, mPER2 and mPER3) revealed a putative nuclear export signal (NES) in the Drosophila PER (Vielhaber et al., J Biol Chem 276, 2001). per transformants carrying a mutation in this NES showed a severe defect in the timing of the nuclear accumulation of PER. Furthermore locomotor behaviour analysis at different temperatures of the transformants revealed an additional defect in temperature compensation. This leads to the conclusion, that Drosophila PER has a functional NES and that the correct timing of nuclear accumulation of PER also is important for a functional temperature compensation.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 12:39
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