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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-8512
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.10683
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 13 July 2008 |
| Referee: | Herbert (Prof. Dr.) Tschochner |
| Date of exam: | 8 August 2007 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Biochemie III > Prof. Dr. Herbert Tschochner |
| Keywords: | Ribosom , RNS-Polymerase I , Transkription <Genetik> , Saccharomyces cerevisiae , Nucleolus , Chromatin , Prozessierung , Ribosomale DNS , rRNA-Prozessierung , rRNA processing |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 10683 |
Abstract (German)
Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, die Komposition und Struktur ribosomalen Chromatins von S. cerevisiae in vivo zu untersuchen. In einer logarithmisch wachsenden Hefezelle wird etwa die Hälfte der ~150 rRNA Gene aktiv von der RNA Polymerase I (Pol I) transkribiert (offene Chromatinform), die andere Hälfte ist inaktiv und nukleosomal organisiert (geschlossene Chromatinform). Die Ergebnisse ...
Abstract (German)
Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, die Komposition und Struktur ribosomalen Chromatins von S. cerevisiae in vivo zu untersuchen.
In einer logarithmisch wachsenden Hefezelle wird etwa die Hälfte der ~150 rRNA Gene aktiv von der RNA Polymerase I (Pol I) transkribiert (offene Chromatinform), die andere Hälfte ist inaktiv und nukleosomal organisiert (geschlossene Chromatinform). Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, daß die Deletion der beiden Transkriptionsfaktorkomplexe UAF (upstream activating factor) und CF (core factor), deren Bindung an den rDNA Promotor für die Pol I Transkription erforderlich ist, dazu führen, daß die ribosomale DNA (rDNA) vollständig in der inaktiven Chromatinform vorliegt. Es konnte zusätzlich gezeigt werden, daß UAF für die Ausbildung der Chromatinstruktur am rDNA Lokus verantwortlich ist.
Die präzise Lokalisierung einzelner chromatinassoziierter Faktoren an der rDNA wurde durch den Einsatz einer neuen Methode, dem ChEC (chromatin endogenous cleavage) möglich (Schmid et al., 2004). Bei dieser Methode wird die Mikrokokken-Nuklease (MNase) mit dem Protein fusioniert, dessen DNA-Bindestellen lokalisiert werden sollen. Die MNase wird in isolierten Nuklei durch Ca2+-Zugabe aktiviert, so daß die DNA an den Stellen geschnitten wird, an denen sie mit dem Fusionsprotein assoziiert ist. Zur Analyse der Dynamik von Assoziations- und Dissoziationsereignissen an der rDNA, in Abhängigkeit von der transkriptionellen Aktivität, wurde eine Kollektion von Hefestämmen mit Fusionsproteinen bekannter rDNA-Bindeproteine etabliert.
Durch die Kombination der ChEC- und der DNA-Vernetzungsanalyse mit Psoralen ist es nun möglich, zu bestimmen, mit welcher der beiden Chromatinformen (offen/ geschlossen) Transkriptionsfaktoren, Komponenten der Pol I Transkriptionsmaschinerie oder Nukleosomen präferentiell assoziiert sind.
Es konnte gezeigt werden, daß am Promotor die UAF- (Uaf30p, Rrn10p) und CF-Komponenten (Rrn7p), Rrn3p, das mit Pol I einen initiationskompetenten Komplex bildet, die RNA Polymerase I, sowie der Transkriptionsfaktor Hmo1p, der mit Pol I synergistisch interagiert, präferentiell mit der offenen Chromatinform assoziiert sind. Im Gegensatz dazu sind die Histone mit beiden Formen assoziiert. Im transkribierten Bereich sind dagegen nur Hmo1p und die RNA Polymerase I mit der offenen und die Histone mit der geschlossenen Chromatinform assoziiert, während alle anderen Transkriptionsfaktoren nicht gebunden sind.
Die ChEC-Analysen zeigten, daß Hmo1p und die RNA Polymerase I an den selben Stellen des transkribierten Bereichs lokalisieren, da sie die gleichen Assoziationsmuster an der rDNA aufweisen. Die Fusionsproteine der UAF- (Uaf30p, Rrn10p) und CF-Komponenten (Rrn7p), sowie Rrn3p weisen neben spezifischen Schnitten in der Promotorregion (schwache) Schnittereignisse in der 2kb stromaufwärtsgelegenen Enhancersequenz auf, was ein Hinweis auf potentielle Interaktion der beiden Elemente ist (möglicherweise durch die Ausbildung von rDNA-Überstrukturen). Zusätzlich konnte gezeigt werden, daß der codierende Bereich der rDNA bei der aktiven Population nahezu frei von Nukleosomen ist und bei inaktiven Genen mit nicht positionierten Nukleosomen besetzt ist. Die intergenen Spacer und die 5S rDNA sind bei beiden Populationen mit positionierten Nukleosomen besetzt.
Nach dem Abschalten der Pol I Transkription durch Nährstoffentzug (Rapamycinbehandlung, Aminosäureentzug) oder Uracildepletion zeigte sich, daß beide Chromatinformen erhalten bleiben und die Assoziation der oben genannten Faktoren mit der rDNA und der jeweiligen Chromatinform unverändert bleibt. Die einzige Ausnahme bildet Rrn3p, das nach dem Nährstoffentzug nicht mehr mit dem rDNA Promotor assoziiert ist. Interessanterweise bleibt die RNA Polymerase I an die rDNA gebunden, obwohl keine RNA mehr synthetisiert wird, was auf einen Regulationsschritt der rRNA Synthese auf Ebene der Elongation hinweist. Die Depletion von Uracil führte erstaunlicherweise dazu, daß die geschlossene Chromatinform teilweise in die offene übergeht.
Die Ergebnisse geben einen Überblick über die strukturellen und kompositorischen Voraussetzungen, die das Chromatin des rDNA Lokuses erfüllen muß, damit Transkription erfolgen kann. Anhand der angewandten Methoden eröffnen sie eine Perspektive, Zusammenhänge zwischen der Chromatinstruktur, der Transkription und der Regulation der Ribosomenbiogenese im Detail besser verstehen zu können.
Translation of the abstract (English)
In a single yeast cell there are approximately 150 rDNA gene copies arranged in a head to tail configuration on chromosome XII. During logarithmic growth only about half of the rDNA genes are actively transcribed by RNA Polymerase I whereas the other half is silenced. Results from Psoralen crosslinking experiments and electron microscopy studies have suggested that special chromatin structures ...
Translation of the abstract (English)
In a single yeast cell there are approximately 150 rDNA gene copies arranged in a head to tail configuration on chromosome XII. During logarithmic growth only about half of the rDNA genes are actively transcribed by RNA Polymerase I whereas the other half is silenced. Results from Psoralen crosslinking experiments and electron microscopy studies have suggested that special chromatin structures are associated with each of the different transcriptional states. The transcription factors UAF (upstream activating factor) and CF (core factor) are multimeric protein complexes, which are binding to the rDNA promoter and are required for transcription.
During my PhD work I could show, that chromatin structure at the endogenous rDNA locus changes substantially in strains with mutations in the transcription factors UAF and CF in comparison with the corresponding wild type strains. Using a special technique, called ChEC (Chromatin Endogenous Cleavage), in which a micrococcal endonuclease (MNase) is C-terminally fused to a DNA-binding protein of interest, I could precisely localize chromatin associated factors on genomic DNA. I was establishing a collection of yeast strains expressing MNase fusion proteins of various rDNA associated factors. These strains were used as tools to study the dynamics of association and dissociation of rDNA chromatin components in dependence on transcriptional activity or repression. I could show, that the 35S rDNA of actively transcribed rDNA is strongly reduced of nucleosomes and the nucleosomes of the inactive 35S rDNA are not positioned.
Combining the ChEC analysis and Psoralen crosslinking experiments it was possible to determine the chromatin structure/s caused by transcription factors, components of the RNA Pol I transcription machinery or nucleosomes. I could show that UAF and CF as well as components of the RNA Pol I complex are preferentially associated with the open chromatin structure whereas nucleosomes bind preferentially to the inactive fraction. In the rDNA promoter region the histones are associated with both fractions.
In summary my work represents the first comprehensive analysis with high resolution of the yeast chromatin structure at the rDNA locus and opens an excellent perspective to understand gene regulation in dependence on different chromatin states.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 12:37
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