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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-8863
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.10684
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 5 August 2008 |
| Referee: | Stephan (Prof. Dr.) Schneuwly |
| Date of exam: | 6 November 2007 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Zoologie > Entwicklungsbiologie (Prof. Dr. Stephan Schneuwly) |
| Keywords: | Darmkrebs , Differentielle Genexpression , Methylierung , Maspin , MLH1 , quantitative Methylierungsanalyse , MGMT , P16 , Maspin , MLH1 , quantitative Methylation Analysis , MGMT , P16 |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 10684 |
Abstract (German)
Diese Dissertation befasst sich mit fehlregulierten Genen im kolorektalen Karzinom (CRC). Das Ziel der Arbeit war die molekularbiologische Charakterisierung dysreguliert-exprimierter Gene im CRC, um neue Einblicke in die Biologie von kolorektalen Tumoren zu gewinnen und um neue diagnostische und prädiktive Marker zu identifizieren. Die Analysen von Expression, Funktion und Bedeutung von Maspin, ...
Abstract (German)
Diese Dissertation befasst sich mit fehlregulierten Genen im kolorektalen Karzinom (CRC). Das Ziel der Arbeit war die molekularbiologische Charakterisierung dysreguliert-exprimierter Gene im CRC, um neue Einblicke in die Biologie von kolorektalen Tumoren zu gewinnen und um neue diagnostische und prädiktive Marker zu identifizieren.
Die Analysen von Expression, Funktion und Bedeutung von Maspin, das in CRC unerforscht war, stellten den Schwerpunkt dieser Dissertation dar.
Maspin wird in CRC tumorspezifisch überexprimiert. Besonders hohe Expression zeigten undifferenzierte Tumore, Mikrosatelliten-instabile (MSI) Tumore, MSI CRC Zelllinien, Tumorzellen der Invasionsfront und disseminierte Tumorzellen.
Die Aktivierung der Maspinexpression erfolgt durch die Demethylierung des Maspinpromotors.
Die Überexpression bewirkte die Ausbildung von Pseudopodien, die Änderung von der Wuchsform als Monolayer zu einer sphäroiden Wuchsform mit starker interzellulärer Adhäsion und hatte eine Verringerung der Proliferationsrate sowie eine langsamere Adhäsion zur Folge. Die Maspin-supprimierten Klone bildeten die Pseudopodien zurück und zeigten beschleunigte Proliferation.
Eine hohe Maspinexpression korrelierte mit gesteigerter Motilität und Invasivität, wobei Maspin seine invasionsverstärkende Wirkung an der Zelloberfläche entfaltet.
In vitro korreliert eine hohe Maspinexpression mit einer höheren Resistenz gegen das Chemotherapeutikum 5-Fluoruracil (5-FU). Dabei beeinflusste die Maspinexpression die Expression der Gene des 5-FU-Stoffwechsels. Die Expression der 5-FU-katabolisierenden Dihydropyrimidindehydrogenase war in den überexprimierenden Klonen stark erhöht, in den supprimierten Klonen hingegen vollständig blockiert. Bei dem Hauptzielmolekül von 5-FU, der Thymidylatsynthase, wurde als Folge der Maspin-Überexpression eine erhöhte Expression und bei den supprimierten Klonen entsprechend eine erniedrigte Expression festgestellt. Die Maspin-Überexpression bewirkte zudem die Expressionsblockierung der Thymidinphosphorylase, welche die 5-FU aktiviert.
Ferner war die Maspin-Überexpression mit einer transkriptionellen Blockierung von der MMP2 und MMP3 assoziiert und die Maspin-Suppression ging mit dem Expressionsausfall von TIMP1 und TIMP3 einher.
Die Daten der Array-basierten Transkriptomanalysen an CRC zeigten einen signifikanten Expressionsanstieg von TS, DPD, TP, MMP1, TIMP1 und MMP10 bei Tumoren mit starker Maspinexpression.
Die Sequenzanalysen von Tumoren, Normalgewebe und CRC-Zelllinien deckten einen S/P Polymorphismus der Aminosäure 144 auf, konnten aber keinen Hinweis auf die Entstehung eines Kernlokalisationssignals, auf Mutationen innerhalb der reaktiven Seitenkette von Maspin oder auf nonsense-Mutationen liefern.
Die nukleäre Lokalisation von Maspin tritt spezifisch bei dedifferenzierten Tumoren und invasiven Tumorzellen auf.
In einer retrospektiven Studie an Stadium III Kolonkarzinom-Patienten erwies sich die nukleäre Maspinlokalisation als ein unabhängiger Marker für eine schlechte Prognose ohne eine 5-FU-basierte Chemotherapie. Nur Patienten mit positiver Maspin-Kernfärbung profitierten von einer Chemotherapie.
In dieser Dissertation wurden zwei neue quantitative DNA-Methylierungsanalysen etabliert: QAMMOD (Quantitative Methylierungsanalyse von modifizierter DNA) und QESD (Quantifizierung Endonuklease-resistenter DNA).
Die DNA-Promotormethylierungen von P16- und MGMT zeigten zwischen den MSI Tumoren und den MSS CRC keine signifikanten Unterschiede, korrelierten aber innerhalb der MSI CRC signifikant mit der Methylierung von MLH1.
Mit Hilfe der QAMMOD und der QESD wurde erstmals die MLH1-Promotormethylierung in hereditären nicht-polypösen kolorektalen Karzinomen (HNPCC) und sporadischen MSI Tumoren analysiert. Dabei wurde bei den HNPCC-Tumoren negative oder schwache MLH1-Methylierung festgestellt. Der Grad der MLH1-Methylierung war bei den HNPCC-Tumoren signifikant niedriger als bei den am MLH1-Promotor durchwegs stark methylierten sporadischen MSI CRC. Mit Hilfe der neuen quantitativen Methylierungsanalysen konnten erstmals Grenzwerte der MLH1-Methylierung definiert werden, welche methylierungsnegative HNPCC-Kandidaten von den methylierungspositiven sporadischen MSI CRC unterscheiden und für weitere diagnostische Untersuchungen selektionieren.
Die QESD ist eine universelle Methode der quantitativen Methylierungsanalyse und wurde innerhalb dieser Dissertation zusätzlich für die quantitative Methylierungsanalyse der Gene GSTP1, CA4, RASSF1, SFRP1, PITX2, CDH3, APC, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B und TS etabliert.
Translation of the abstract (English)
This dissertation focuses on the molecular analysis of aberrantly regulated genes in colorectal cancers (CRC) in order to obtain insights in tumor biology and to identify new diagnostic and predictive markers. The biological effects of tumor-associated genes were studied in vitro by functional assays with overexpressing and suppressed tumor cell lines and RNA, DNA and protein from normal colonic ...
Translation of the abstract (English)
This dissertation focuses on the molecular analysis of aberrantly regulated genes in colorectal cancers (CRC) in order to obtain insights in tumor biology and to identify new diagnostic and predictive markers. The biological effects of tumor-associated genes were studied in vitro by functional assays with overexpressing and suppressed tumor cell lines and RNA, DNA and protein from normal colonic mucosa, CRC and CRC cell lines were analyzed with independent methods.
In tumors aberrant DNA methylation is often the cause of gene-deregulation. Thus new accurate and powerful methods for quantitative DNA methylation analysis were established.
The main target of investigation was maspin (mammary serine protease inhibitor), the product of the gene SERPINB5, which was virtually unexplored in CRC.
Maspin is tumorspecifically overexpressed in CRC, most notably at the invasion front of tumors, in disseminated tumor cells, in CRC with microsatellite instability (MSI) and in dedifferentiated tumors. Maspin expression in MSI CRC cell lines was elevated 28-fold compared to microsatellite-stable (MSS) CRC cell lines. The maspin promoter was hypermethylated in maspin negative tissues and cell lines, but all maspin expressing CRC and cell lines had unmethylated maspin-promoters. Thus in CRC maspin expression is activated by loss of promoter methylation (loss of imprinting).
Maspin overexpression in the CRC cell line SW480 (weak expression in wild type) induced a switch from growth form as monolayer to a spheroid growth with strong intercellular cell adhesion. Additionally the cells developed motility structures as pseudopodia and filopodia and had decreased proliferation rates.
In contrast the suppression of maspin in the CRC cell line SW80 (strong expression in wild type) was accompanied with the loss of pseudopodia and increased proliferation.
Maspin expression is negatively correlated with cell adhesion and positively correlated with tumor cell motility and invasiveness through an artificial basement membrane. Tumor cell invasiveness was blocked by an anti maspin-antibody, but strongly stimulated in the presence of 1 µM purified recombinant maspin. Thus Maspin promotes invasiveness on the cell surface.
In vitro maspin expression was correlated with decreased sensitivity to 5-fluor uracile (5-FU) which is used in chemotherapy. The levels of dihydropyrimidin dehydrogenase (DPD) which catabolizes 5-FU were significantly increased by maspin overexpression but suppression of maspin resulted in complete loss of DPD expression. The expression of thymidylate synthase (TS), which is the main target of 5-FU, showed positive correlation to maspin expression. Additionally maspin overexpression blocked the expression of the 5-FU activating enzyme thymidine phosphorylase (TP).
In CRC cell lines maspin overexpression resulted in the loss of expression of the matrix metalloproteinase (MMP) 2 and MMP3. In SW48 maspin suppression blocked the expression of TIMP1 (tissue inhibitor of matrixmetalloproteinases 1) and TIMP3.
Microarray analysis of CRC showed significantly increased expression of TS, DPD, TP, MMP1, TIMP1 and MMP10 in tumors with strong maspin expression.
Sequence analysis discovered a S/P polymorphism of residue 144, but neither nonsense mutations nor mutations in the reactive side loop were detected.
In a retrospective study with 162 stage III CRC nuclear localisation of maspin revealed to be a marker for a poor prognosis for CRC patients that were not treated by adjuvant 5-FU-based chemotherapy. Patients without nuclear maspin localisation had no benefit from chemotherapy.
In this dissertation two new SYBR Green� real-time PCR based methods for quantitative DNA methylation analysis were established: QAMMOD (quantitative methylation analysis of modified DNA) and QESD (quantification of endonuclease-resistent DNA).
The QESD method was applied for the quantitative promoter methylation analysis of P16, MGMT and MLH1.
MSS and MSI CRC showed no significant differences in the methylation of P16- and MGMT, but in MSI CRC methylation of P16 and MGMT was significantly correlated with positive MLH1-methylation.
With the help of QAMMOD and QESD, the promoter methylation of MLH1 was analyzed for the first time quantitatively in hereditary non-polyposis colorectal cancer (HNPCC) and compared to the MLH1 methylation of sporadic MSI CRC.
In HNPCC the degree of MLH1 promoter methylation was significantly lower than in sporadic MSI CRCs which showed constantly high values of MLH1 methylation. For the first time threshold values for positive MLH1 methylation could be established, enabling the selection of MLH1 methylation negative HNPCC candidates among the sporadic MSI CRC with positive MLH1 methylation for further analysis. The QESD is an universal methylation analysis method that have already been established for GSTP1, CA4, RASSF1, SFRP1, PITX2, CDH3, APC, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B and TS.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 12:35
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