| Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen ohne Print on Demand (13MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-8821
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.10688
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 19 Oktober 2008 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Ludwig (Prof. Dr.) Lehle |
| Tag der Prüfung: | 20 September 2007 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Pflanzenwissenschaften > Lehrstuhl für Zellbiologie und Pflanzenphysiologie (Prof. Dr. Klaus Grasser) |
| Stichwörter / Keywords: | Hefeartige Pilze , Enzymsubstrat , Saccharomyces cerevisiae , Glycosyltransferasen , Biochemische Analyse , Hefe , Protein-N-Glykosylierung , Glykosyltransferase , Dolichol , Lipid-Oligosaccharid , yeast , protein-N-glycosylation , glycosyltransferase , dolichol , lipid-linked-oligosaccharide |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 10688 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Die Protein-N-Glykosylierung ist eine für Wachstum und Entwicklung von Organismen essentielle Modifikation. Sie ist, was die ER lokalisierten Reaktionen betrifft, konserviert von der Hefe S. cerevisiae bis zum Menschen. Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung und funktionelle Charakterisierung der bislang unbekannten N-Acetylglukosamintransferase (GNT), die am Aufbau des lipidgebunden ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Die Protein-N-Glykosylierung ist eine für Wachstum und Entwicklung von Organismen essentielle Modifikation. Sie ist, was die ER lokalisierten Reaktionen betrifft, konserviert von der Hefe S. cerevisiae bis zum Menschen.
Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung und funktionelle Charakterisierung der bislang unbekannten N-Acetylglukosamintransferase (GNT), die am Aufbau des lipidgebunden Core-Oligosaccharids beteiligt ist und den zweiten Reaktionsschritt, die Bildung von Dol-PP-GlcNAc2, katalysiert. Dabei wurde eine neuartige Transferase gefunden, die aus zwei Proteinen besteht und nur als Dimer funktionell ist. Das Dimer besteht aus einer membrangebundenen Untereinheit, Alg14p, welche die lösliche Alg13p Komponente an die ER Membran rekrutiert. Alle anderen Mannosyl- und Glukosyltransferasen, sowie die N Acetylglukosaminphosphattransferase (GPT) der Lipid-Oligosaccharid Assemblierung, bestehen aus nur einer Polypeptidkette.
Die entsprechenden codierenden Gene wurden in silico durch Sequenzvergleiche und mit Hilfe von Datenbankrecherchen identifiziert, anschließend isoliert und die abgeleiteten Proteine hinsichtlich ihrer Funktion charakterisiert.
In vivo Untersuchungen zeigten bei Repression der Proteine Alg13 und Alg14 durch Tetracyclin bzw. Galaktose regulierbare Promotoren (PTET, PGAL) die Akkumulation von Dol-PP-GlcNAc1 und als Folge die Unterglykosylierung der Glykoproteine CPY und WbpI. Spezifische in vitro Enzymtests ergaben, dass Alg13 und Alg14 nur als Dimer die Übertragung des GlcNAc-Rests von UDP-GlcNAc auf Dol-PP-GlcNAc1 katalysieren.
Die Membranbindung der löslichen Komponente Alg13p ist abhängig von der Expression des membranständigen Proteins Alg14p. Mit Hilfe von Fusionskonstrukten wurde die Membran-topologie von Alg14p aufgeklärt. Dabei wurden sowohl eine Biotinylierungssequenz als auch die Histidinol-Dehydrogenase verwendet. Beide Epitope werden ausschließlich im Cytoplasma modifiziert bzw. sind ausschließlich im Cytoplasma aktiv. Auf diese Weise war eine Aussage über die Orientierung des C-Terminus von verkürzten Alg14p Konstrukten möglich. Entgegen der Vorhersagen, basierend auf Hydropathieanalysen, die 2-3 Transmembransegmente postulierten, enthält Alg14p nur eine Transmembranspanne am N-Terminus im Bereich der Aminosäuren 10-30. Mit Hilfe von verkürzten Alg14p Konstrukten konnte gezeigt werden, dass die Interaktion mit Alg13p im N-terminalen Bereich bis Aminosäure 117 stattfindet.
Die Interaktion der GNT Untereinheiten sollte durch Mutationsanalysen näher charakterisiert werden. Dabei wurden sowohl für Alg13p als auch für Alg14p für die Enzymaktivität essentielle Aminosäuren identifiziert, die jedoch für die Dimerisierung ohne Bedeutung sind. Der Austausch eines hoch konservierten Aspartats (D125) in Alg13p führt zu einem inaktiven Enzym, wohingegen Mutationen in anderen konservierten Bereichen (114VISHAG119, 131KPLIV135, 141LMDNHQ146) die Enzymaktivität nicht beeinflussen. Im Gegensatz zu Alg13p, sind die konservierten Aminosäure-abschnitte von Alg14p, 162NGPXC166, 189IVYXES194 und 202SLTG205, für die Enzymaktivität entscheidend. Die essentiellen Aminosäuren wurden mittels Zufallsmutagenese und zielgerichteter Mutagenese ermittelt.
Alg13p, heterolg in E. coli exprimiert, bildete im in vitro Test mit Alg14p ein aktives Enzym. Alg13p alleine besitzt jedoch keine Enzymaktivität.
Das Alg13p Homolog aus S. pombe ist in S. cerevisiae vollständig aktiv. Die Untersuchung der humanen Homologen hAlg13p bzw. hAlg14p ergab, dass durch die einzeln exprimierten Proteine in Verbindung mit dem jeweils komplementären Protein aus S. cerevisiae die Bildung von Dol-PP-GlcNAc2 nicht katalysiert wird. Dies ist auf die fehlende Interaktion der humanen Proteine mit S. cerevisiae Alg13p bzw. Alg14p zurückzuführen.
Die Suche nach weiteren Homologen führten zu der Entdeckung eines bisher nicht charakterisierten offenen Leserahmens aus Leishmania major. Dieses nur aus einer Polypeptidkette aufgebaute Enzym besitzt im N-terminalen Bereich Homologie zu Alg14p, in der C-terminalen Hälfe zu Alg13p. Bei heterologer Expression in S. cerevisiae ist das L. major Alg14-Alg13 Protein in der Lage, die Bildung von Dol PP GlcNAc2 zu katalysieren. Wurde der �ALG14-ALG13� ORF aus L. major in die Untereinheiten getrennt, war mit den jeweils komplementären Hefeproteinen keine GNT Aktivität zu generieren.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Protein-N-glycosylation in the endoplasmic reticulum is an essential protein modification highly conserved in evolution from yeast to man. Goal of this study was the identification and functional characterisation of the so far unknown UDP-GlcNAc: GlcNAc1-PP-Dol GlcNAc-transferase (GNT) catalysing the formation of GlcNAc2-PP-dolichol (Dol), the second step in the biosynthesis of the unique ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Protein-N-glycosylation in the endoplasmic reticulum is an essential protein modification highly conserved in evolution from yeast to man.
Goal of this study was the identification and functional characterisation of the so far unknown
UDP-GlcNAc: GlcNAc1-PP-Dol GlcNAc-transferase (GNT) catalysing the formation of GlcNAc2-PP-dolichol (Dol), the second step in the biosynthesis of the unique lipid-linked core oligosaccharide Glc3Man9GlcNAc2-PP- Dol.
It was found that the enzyme represents a novel type of bipartite GlcNAc-transferase, consisting of a membrane bound, Alg14p, and a cytosolic, Alg13p, subunit, thereby the membrane protein Alg14 recruits the soluble Alg13 to the endopalsmic reticulum.
Both genes were uncovered in silico using sequence homology comparisons. The genes were isolated and the derived proteins biochemically characterised.
Down-regulation of Alg13p or Alg14p via controllable promoters (PTET , PGAL ) led to a defect in protein-N-glycosylation as revealed by the underglycosylation of the glycoproteins CPY and Wbp1, and furthermore by the accumulation of GlcNAc1-PP-Dol in vivo upon metabolic labeling with [3H]glucosamine.
Analysis of the GNT activity in vitro with solubilized enzyme extract showed that both proteins are required for formation of GlcNAc2-PP-Dol. Repression of the membrane protein Alg14 causes the depletion of Alg13p from the membrane fraction.
The membrane topology of Alg14p was solved by chimeric proteins of Alg14 which had a C-terminal biotinylation site or the His4C protein C-terminal fused to Alg14 variants. Due to the specific, exclusive activity of the protein-biotin-ligase and the histidinol dehydrogenase, the C-terminal orientation of truncated Alg14 versions could be analysed. Unlike predicted, Alg14p has only one transmembrane segment within the N-terminal domain between amino acides 10 and 30. Studies with truncated Alg14 proteins demonstrated, that the interaction with Alg13 occurs in the N-terminal half of Alg14p up to aa 117.
The analysis of modified Alg14p and Alg13p, respectively, obtained from random or site directed mutagenesis identified amino acids which are essential for enzyme activity. However these substitutions did not affect the interaction of Alg13p with Alg14p. A highly conserved aspartate (D125) in Alg13 causes loss of enzymatic activity. Amino acids exchanges within other conserved regions (114VISHAG119, 131KPLIV135, 141LMDNHQ146) had no influence on enzyme function. In the case of Alg14p, the conserved regions 162NGPXC166, 189IVYXES194 and 202SLTG205 were found to be crucial for enzyme activity.
Alg13p heterologous expressed in E. coli was able to generate an active GlcNAc transferase only together with Alg14p from yeast. Alg13p alone had no enzymatic activity.
The homologous Alg13 protein from S. pombe generates a fully active GNT together with Alg14p from S. cerevisiae. On the other hand, the human proteins hAlg13 and hAlg14, respectively, are not able to interact with the corresponding S. cerevisiae proteins when expressed alone in yeast and therefore do not generate an active GlcNAc transferase.
Further research resulted in the discovery of an uncharacterised open reading frame in the Trypanosoma Leishmania major. The protein L. major Alg14-Alg13p is composed of only one polypeptide chain with homologous regions to Alg13p, within the C-terminal half of the protein, and Alg14p, within the N-terminal half. The L. m. Alg14-Alg13 protein was able to catalyse the formation of GlcNAc2 PP-Dol in S. cerevisiae, when the endogenous genes were repressed. Yet the expression of the Alg14p and Alg13p domains as seperated entities were not able to form GlcNAc2-PP-Dol with the respective other yeast proteins.
Metadaten zuletzt geändert: 25 Nov 2020 15:08
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