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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-8675
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.10689
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 23 October 2008 |
| Referee: | Claudia (Prof. Dr.) Steinem |
| Date of exam: | 5 October 2007 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik |
| Keywords: | Ionenkanal , Nickelion , Bipyridine , Voltage-Clamp-Methode , Ligand-Rezeptor-Wechselwirkung , Einzelkanalmessungen , Artifizielle Membranen , ligand-receptor interactions , single channel recordings , artificial membranes |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 10689 |
Abstract (German)
Ziel dieser Arbeit war es ein neues Sensorsystem basierend auf einer Liganden (Analyten)-gesteuerten Kontrolle der Assemblierung amphipatischer a-Helices zu entwickeln. Das Konzept basierte auf einem peptidischen Ionenkanal, der mit einer Rezeptorfunktion versehen wird, über die die Anbindung eines Analyten erfolgt. Als Peptidkomponente wurde das Peptid LS3 gewählt, von dem bekannt ist, dass es ...
Abstract (German)
Ziel dieser Arbeit war es ein neues Sensorsystem basierend auf einer Liganden (Analyten)-gesteuerten Kontrolle der Assemblierung amphipatischer a-Helices zu entwickeln. Das Konzept basierte auf einem peptidischen Ionenkanal, der mit einer Rezeptorfunktion versehen wird, über die die Anbindung eines Analyten erfolgt. Als Peptidkomponente wurde das Peptid LS3 gewählt, von dem bekannt ist, dass es spannungsgesteuert in Lipiddoppelschichten insertiert und kationenselektive Ionenkanäle bildet. Eine an das Peptid gebundene Bipyridineinheit sollte als Rezeptorfunktion für das Übergangsmetallkation Ni2+ fungieren, da diese bekanntermaßen sehr stabile Komplexe miteinander ausbilden. Es wurde erwartet, dass sich die Bindung von Ni2+ an das rezeptorfunktionalisierte Peptid bpy*-LS3 in veränderten Kanaleigenschaften des Peptids, wie z. B. der Leitfähigkeit, der Öffnungsdauer oder der Kanalaktivität, widerspiegelt.
Zunächst wurde das Peptid LS3 mittels automatisierter Festphasensynthese unter Anwendung der Fmoc/tert-Butyl-Taktik synthetisiert. Zur Anbindung der Rezeptorfunktion an den N-Terminus der Peptidhelix wurde ein 2,2´-Bipyridin-Derivat (bpy*) mit einem Alkylspacer und endständiger Carboxylfunktion hergestellt, so dass das rezeptorfunktionalisierte Peptid bpy*-LS3 erhalten wurde.
Für das Peptid LS3 wurde bei Einzelkanalmessungen an klassischen BLMs in 0.5 M KCl bei einem Membranpotential von +200 mV eine Leitfähigkeit von (106 ± 28) pS und einer mittleren Öffnungsdauer von (1.82 ± 0.01) ms ermittelt. In nano-BLMs, welche die Poren von porösem Aluminiumoxid mit Porendurchmessern von 60 nm überspannen, wurden dagegen acht Leitfähigkeitsstufen im Bereich von (101 ± 19) pS bis (1011 ± 53) pS identifiziert und die mittlere Öffnungsdauer betrug (3.6 ± 0.1) ms. Das Auftreten von höheren Leitfähigkeitsstufen wurde auf eine durch die Porenstege des Substrats räumlich eingeschränkte Diffusion der Peptide in nano-BLMs zurückgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass die unterschiedlichen Leitfähigkeitsstufen von LS3 aus der Aggregation von 6 � 13 Monomeren resultieren. Die längere mittlere Öffnungsdauern in nano-BLMs kann auf einem geringeren Lösungsmittelanteil oder dem eingeschränkten Diffusionsraum basieren.
Die Komplexierung des rezeptorfunktionalisierten Peptids bpy*-LS3 mit Ni2+ wurde UV-spektroskopisch belegt. Anhand der Rezeptorfunktion bpy* wurde gezeigt, dass der angebrachte Alkylspacer verglichen zu 2,2´-Bipyridin lediglich eine gewisse Destabilisierung des 3:1-Komplexes von bpy* mit Ni2+ verursacht. In Mizellen oder Vesikeln ist aufgrund einer starken Wechselwirkung der Rezeptorfunktion mit der hydrophoben Phase die Komplexbildung kinetisch retardiert.
Das rezeptorfunktionalisierte Peptid bpy*-LS3 zeigte in klassischen BLMs lediglich ein Detergenz-ähnliches Verhalten, das auf eine Destabilisierung der Membran durch den Durchtritt der Rezeptorfunktion zurückgeführt werden kann. In die mechanisch stabileren nano-BLMs konnte bpy*-LS3 erfolgreich inkorporiert werden. Die bei einem Membranpotential von +200 mV in 0.5 M KCl ermittelten Leitfähigkeitsstufen betrugen G1 = (134 ± 20) pS, G2 = (181 ± 15) pS, G3 = (225 ± 27) pS und G4 = (373 ± 63) pS und resultierten ausgehend von einer hexameren Struktur aus Helix-Bündeln mit bis zu 9 Monomeren. Die Öffnungsdauer der Ionenkanäle wies eine exponentielle Verteilung 3. Ordnung auf mit drei mittleren Öffnungsdauern von tau1 = (3.6 ± 0.2) ms, tau2 = (15.1 ± 0.6) ms und tau3 = (63 ± 4) ms, die unabhängig von der Leitfähigkeitsstufe auftraten. Dies lässt auf das Vorliegen von drei Helix-Bündel-Populationen schließen, die sich in der räumlichen Orientierung der Rezeptorfunktionen unterscheiden.
In Gegenwart von 2.5 � 5.0 uM Ni2+ konnte in nano-BLMs eine Modulation der Kanaleigenschaften des rezeptorfunktionalisierten Peptids bpy*-LS3 induziert werden. Zum einen nahm der Anteil an Ereignissen mit höherer Leitfähigkeit ab. Dies wurde darauf zurückgeführt, dass sich komplexierte Peptide innerhalb der Lipiddoppelschicht abstoßen, wodurch die Zahl der zur Bündelbildung fähigen Peptide abnimmt. Zum anderen konnte eine Abnahme der Häufigkeit von Ereignissen mit längerer Öffnungsdauer beobachtet werden. Es wurde geschlossen, dass diese Abnahme auf Helix-Bündeln basieren, in denen ein Großteil der Rezeptorfunktion in die wässrige Phase ragt. Aufgrund der elektrostatischen Abstoßung der komplexierten Peptide sinkt somit die Wahrscheinlichkeit für das Auftreten von längeren Ereignissen.
Durch die Komplexbildung zwischen kovalent an ein amphipatisches Peptid gebundenem 2,2´-Bipyridin und Ni2+ konnte die Assemblierung der Peptide zu Helix-Bündeln modifiziert werden. Das entwickelte System könnte somit neue Perspektiven für die Entwicklung maßgeschneiderter Sensoren bieten.
Translation of the abstract (English)
The aim of this study was to develop a new detection scheme based on a ligand (analyte)-induced control of the assembly of amphipatic a-helical peptides. The concept was based on a peptidic ion channel functionalized with a receptor moiety which allows for binding of the analyte. The peptide H2N-(LSSLLSL)3-CONH2 (LS3) which is known to form ion channels after insertion into lipid bilayers in ...
Translation of the abstract (English)
The aim of this study was to develop a new detection scheme based on a ligand (analyte)-induced control of the assembly of amphipatic a-helical peptides. The concept was based on a peptidic ion channel functionalized with a receptor moiety which allows for binding of the analyte. The peptide H2N-(LSSLLSL)3-CONH2 (LS3) which is known to form ion channels after insertion into lipid bilayers in presence of a transmembrane voltage served as peptide component. The ligand-receptor interaction was based on the complexation of Ni2+ with a bipyridine moiety (bpy*) which was covalently linked to the N-terminus of the peptide via a carboxy-terminated spacer.
Successful complex formation of the receptor-functionalized peptide bpy*-LS3 in presence of Ni2+ was demonstrated by UV/Vis-spectroscopy. Complexation of the receptor moiety itself was also investigated by means of UV/Vis-spectroskopy, revealing that the complex formation is kinetically retarded in presence of micelles and vesicles, which indicates a strong interaction of the receptor moiety with the hydrophobic phase.
The ion channel characteristic of the receptor-functionalized peptide bpy*-LS3 in absence and presence of Ni2+ and of the peptide component LS3 were investigated in two different artificial model membranes, namely classical black lipid membranes (BLMs) and nano-BLMs, which suspend the pores of porous aluminium oxide.
In classical BLMs the receptor-functionalized peptide bpy*-LS3 acted similar to a detergent. This was ascribed to a destabilisation of the membrane due to the penetration of the receptor moiety across the membrane. After incorporation into the more robust nano-BLMs, bpy*-LS3 exhibited four conductance states of (134 ± 20) pS, (181 ± 15) pS, (225 ± 27) pS and (373 ± 63) pS at a membrane voltage of +200 mV in 0.5 M KCl. The open time distribution of the channels formed by bpy*-LS3 was described by a triple exponential decay function with three mean open lifetimes of (3.6 ± 0.2) ms, (15.1 ± 0.6) ms and (63 ± 4) ms which showed no dependency on the conductance state. This was attributed to three different helix bundle populations, which vary in their orientations of the receptor moieties. In presence of 2.5 � 5.0 uM Ni2+ modulations of the channel characteristics were observed. On the one hand, the probability to find channels in higher conductance states was decreased. Since complexed peptides are supposed to repel each other due to the charged metal ion, this leads to a decreasing number of peptides in the membrane, which are able to assemble in helix bundles. On the other hand, there was a decrease in long lasting channel events which indicates that these are results from bundles composed of peptides were the majority of receptor moieties protrudes from the lipid bilayer surface into the water phase.
In conclusion, it was demonstrated that complex formation of a bipyridine moiety attached to an amphipathic peptide by Ni2+ alters the assembly process of helix bundles. The developed concept might provide new prospects to tailored sensor schemes.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 15:07
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