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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-9196
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.10702
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 29 Januar 2008 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Hans-Robert (Prof. Dr. Dr.) Kalbitzer |
| Tag der Prüfung: | 26 November 2007 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Dr. Hans Robert Kalbitzer |
| Stichwörter / Keywords: | Impfstoff , Komplement C3d , HIV , HIV Envelope Protein gp120 , Adjuvans , Viren , DNA-Vakzine , Kodonoptimierung , Signalpeptid , stabile Zellen , VLP , C3d , HIV gp120 , DNA vaccine , codon optimization , VLP |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 10702 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Angesichts von bislang 20 Millionen Toten und einer jährlichen Zahl von über vier Millionen Neuinfektionen ist ein prophylaktischer Impfstoff gegen das humane Immundefizienzvirus Typ-1 (HIV-1) dringend notwendig, um die AIDS-Pandemie zu kontrollieren. Für einen effektiven Impfstoff gegen HIV-1 ist eine Induktion von humoralen und zellulären Immunantworten erforderlich. Insbesondere ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Angesichts von bislang 20 Millionen Toten und einer jährlichen Zahl von über vier Millionen Neuinfektionen ist ein prophylaktischer Impfstoff gegen das humane Immundefizienzvirus Typ-1 (HIV-1) dringend notwendig, um die AIDS-Pandemie zu kontrollieren. Für einen effektiven Impfstoff gegen HIV-1 ist eine Induktion von humoralen und zellulären Immunantworten erforderlich. Insbesondere neutralisierende Antikörper sind von Bedeutung, da sie Viren bereits beim Eintritt in den Körper abfangen bzw. deren Ausbreitung im Verlauf der Infektion verhindern können. Neutralisierende Antikörper sind ausschließlich gegen das virale Hüllprotein Env gerichtet, besonders gegen den externen Teil gp120, da Env als einziges virales Protein auf der Oberfläche des HI-Virus präsentiert wird. Eine Vakzinierungsstrategie, die sowohl humorale als auch zelluläre Immunantworten induziert, ist die Verabreichung von Plasmid-DNA. Bei bisherigen Immunisierungen mit HIV-1 Env DNA zeigte sich jedoch, dass aufgrund der niedrigen Expression und Sekretion bei Verwendung der Env-Wildtypsequenzen und der geringen immunstimulatorischen Eigenschaften des Env-Proteins nur eine schwache Immunantwort generiert wurde.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Immunogenität des HIV-1 Hüllproteins gp120 im Rahmen eines DNA-Impfstoffs zu verbessern. Folgende Strategien wurden dabei angewandt: (i) Zur Steigerung der Expressionsrate wurden an den Kodongebrauch von hochexprimierenden Säugetiergenen angepasste Sequenzen verwendet, (ii) zur Verbesserung der Sekretion und einer dadurch erhöhten Stimulation von B-Zellen erfolgte die Überprüfung verschiedener Signalpeptide und (iii) wurde zur natürlichen Adjuvierung dreimal die Sequenz der humanen Komplementkomponente C3d (hC3d3) an die gp120-Sequenz fusioniert. Die immunstimulatorische Wirkung von C3d beruht auf dessen Bindung an den Rezeptor CD21, der sich auf B-Zellen und follikulären dendritischen Zellen befindet. Diese Bindung hat eine verbesserte Aktivierung der B-Zellen und eine verstärkte Präsentation des Antigens zur Folge.
Die kodonoptimierten DNA-Konstrukte erzielten eine hohe und langanhaltende Expression von gp120-Proteinen in 293T-Zellen. Während die Signalpeptidvarianten keinen Einfluss auf die Freisetzung der gp120-Proteine hatten, wurde nach Fusion von hC3d3 eine Verringerung der Expressions- wie auch der Sekretionsraten des gp120hC3d3-Fusionsproteins gegenüber dem nicht fusionierten gp120-Protein festgestellt. Die niedrige Expression war unabhängig von der Transfektionseffizienz, was mit einem Fusionskonstrukt, das zwischen gp120 und hC3d3 zwei Stopkodons enthielt, gezeigt werden konnte. Ferner korrelierte die Luciferaseaktivität eines endogenen Luciferasegens mit der jeweiligen Länge des translatierten gp120-Konstrukts, was darauf hindeutet, dass vorwiegend die Fusion der hC3d3-Sequenz zu einer Verringerung der Sekretionseffizienz führte.
Die für die immunstimulatorische Wirkung notwendige Bindung von C3d an CD21 konnte für sezerniertes gp120hC3d3 mit B-Zellen nachgewiesen werden. Humanes C3d kann an CD21-Rezeptoren unterschiedlicher Spezies binden, daher wurden die gp120- und gp120hC3d3-Konstrukte in Mäusen und Kaninchen auf ihre Immunogenität hin überprüft. In Analogie zu den in vitro-Daten induzierten gp120hC3d3-Fusionskonstrukte nach Immunisierung niedrigere Antikörpertiter als gp120-Konstrukte. Die verringerte Antikörperbildung wurde auf die im Vergleich mit gp120 geringeren Expressions- und Sekretionsraten der gp120hC3d3-Fusionsproteine zurückgeführt. Zelluläre Immunantworten wurden durch die hC3d3-Kopplung nicht beeinflusst. Die Kodonoptimierung von gp120 führte zu einer effizienten Expression und zu guten humoralen und zellulären Immunantworten. Die Fusion des Adjuvans hC3d3 konnte diese Immunantworten nicht weiter steigern.
Um die Verringerung der in vivo-Expression nach Fusion von hC3d3 zu umgehen, wurden Konstrukte generiert, die eine Präsentation von Env- und C3d-Proteinen auf der Oberfläche von virusähnlichen Partikeln (VLP) ermöglichten. Diese VLP Konstrukte basieren auf einer kodonoptimierten Gag-Sequenz und den zuvor generierten DNA Konstrukten, an die zur Verankerung von Env bzw. C3d in der VLP-Membran eine Transmembrandomäne (TM) fusioniert wurde. Im 293T Zellkultursystem konnte eine effiziente Expression und Sekretion der VLP nachgewiesen werden. Um diese HIV-1 VLP in großem Maßstab in eukaryontischen Zellen zu produzieren, wurden gp140- und hC3d-stabile Zelllinien etabliert. In weiterführenden Mausstudien sollen diese VLP auf Ihre Immunogenität hin überprüft werden.
In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass weder die Verwendung unterschiedlicher Signalpeptide noch hC3d3-Fusion die Sekretion oder die Immunogenität kodonoptimierter gp120-Konstrukte verbessert. Die aufgrund der Größe der Fusionsproteine eingeschränkte Sekretion kann durch die neu generierten VLP umgangen und dadurch das Potential des immunstimulatorischen Faktors C3d3 besser genutzt werden.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
The estimated number of persons living with the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) worldwide in 2007 was 33.2 million, whereas over four million people became newly infected. Thus, to control the alarming spread of HIV-1, a vital need exists for developing an effective vaccine that would prevent individuals from infection. The immediate goal of HIV vaccine research is to design candidate ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
The estimated number of persons living with the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) worldwide in 2007 was 33.2 million, whereas over four million people became newly infected. Thus, to control the alarming spread of HIV-1, a vital need exists for developing an effective vaccine that would prevent individuals from infection. The immediate goal of HIV vaccine research is to design candidate vaccines that cause the immune system to produce protective responses from both of its major arms � cellular immunity and neutralizing antibodies. The main mode of protection that is induced by most antiviral vaccines seems to be mediated by neutralizing antibodies. Even during early phases of infection, when the level of antibodies induced by active immunization or administered by passive immunization is low, antibodies can reduce the size of the infecting inoculum and neutralize or eliminate virions during the first rounds of replication. In the case of HIV-1, this type of inhibition is attributed to antibodies that target the virus glycoprotein Env, especially to antibodies that are specific for the external part gp120. One vaccine strategy inducing both major arms of the adaptive immune system, humoral and cellular immunity, is the application of plasmid DNA. However, previous immunizations demonstrated that HIV Env DNA vaccines are relatively inefficient at inducing strong humoral and cellular immune responses.
In this study, three different approaches were used to enhance the immunogenicity of Env expressed from a DNA vaccine: (i) use of RNA- and codon-optimized gene inserts to increase expression rates, (ii) test of different signalpeptides to maximize secretion efficiency of the translated gp120 proteins and (iii) fusion of three copies of the molecular adjuvant human C3d (hC3d3). The immunostimulatory effect of C3d depends on the binding to its receptor CD21, located on B cells and follicular dendritic cells, thereby leading to an improved activation of B cells and an enhanced presentation of the antigen.
The generated DNA vaccines encoding a secreted monomeric form of a C-clade gp120 and C-terminally fused to three copies of the human C3d sequence (hC3d3) achieved a high and long-lasting expression of gp120 proteins in 293T cells. Whereas signal peptide variations had no influence on gp120 release from transfected mammalian cells, the C3d fusion markedly impaired expression as well as secretion rates of gp120. A construct containing two stop codons between gp120 and hC3d3 confirmed that the reduced expression is not depending on the transfection efficiency. Furthermore, the luciferase activity of an endogenous luciferase gene correlated with the length of the translated gp120 constructs, suggesting that the junction of hC3d3 leads to a decreased secretion efficiency of the fusion proteins.
Moreover, the hC3d3 moiety of secreted gp120 fusion proteins was capable of binding specifically to its receptor CD21 on B-cells. Since human C3d is able to bind CD21 receptors of other species, it was possible to test the gp120hC3d3 fusion constructs in mice and rabbits.
The most potent DNA constructs were tested in BALB/c-mice and in rabbits for the induction of reactive antibodies and T-cell responses. Short and long term immunization protocols revealed that the compromised production of hC3d3-fused antigens resulted in low gp120-specific antibody titers. However, gp120 DNA vaccines induced comparable T-cell responses in mice irrespective of hC3d3. In summary, these data suggest that the adjuvant properties of C3d were not capable of compensating the negative effects of poor expression on the stimulation of gp120-specific immune responses.
To overcome the limitations of gp120hC3d3 in vivo expression new constructs were designed allowing presentation of Env and C3d proteins on the surface of virus-like particles (VLP). These VLP constructs are based on a codon-optimized Gag sequence as well as on Env and C3d sequences fused to a transmembrane region (TM) anchoring the Env and C3d proteins in the VLP membrane. The efficient expression and secretion of Env- and C3d-bearing VLP was confirmed after transfection in 293T cells. Stable cell lines expressing Env and C3d on their surface were generated to enable a high production of HIV-1 VLP in eukaryotic cells. Further in vivo studies are planned to investigate the immunogenicity of these VLP.
This study indicates that neither use of different signal peptides nor hC3d3 fusion improve secretion efficiency or immunogenicity of codon-optimized gp120 DNA constructs. However, with the new designed VLP constructs it may be possible to overcome the reduced secretion efficiency of gp120hC3d3 fusion proteins and consequently improving the immunostimulatory potential of C3d.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 12:34
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