Abstract (German)
Ribosomensynthese findet nur in wachsenden eukaryotischen Zellen statt. Sobald ein Wachstumsarrest eintritt, werden sowohl die rRNA-Synthese als auch die RP (ribosomale Proteine)-Genexpression inhibiert. Die nukleolären rRNA-Gene werden in Eukaryoten von der RNA Polymerase I (Pol I) transkribiert. Diese synthetisiert ein Vorläufertranskript (Prä-rRNA), aus dem mit der 18S-, der 5,8S- und der ...
Abstract (German)
Ribosomensynthese findet nur in wachsenden eukaryotischen Zellen statt. Sobald ein Wachstumsarrest eintritt, werden sowohl die rRNA-Synthese als auch die RP (ribosomale Proteine)-Genexpression inhibiert. Die nukleolären rRNA-Gene werden in Eukaryoten von der RNA Polymerase I (Pol I) transkribiert. Diese synthetisiert ein Vorläufertranskript (Prä-rRNA), aus dem mit der 18S-, der 5,8S- und der 28S/25S-rRNA drei der vier reifen eukaryotischen rRNAs hervorgehen. Um die Transkription an den Promotoren der rRNA-Gene initiieren zu können, muss die RNA-Polymerase I mit dem Transkriptionsfaktor Rrn3(p) assoziiert sein. Sowohl in Säugern als auch in der Hefe S. cerevisiae rekrutiert Rrn3(p) das Enzym an den Transkriptionsstartpunkt. Da wachstumsarretierte Zellen deutlich geringere Mengen des zur Initiation benötigten Pol I-Rrn3(p)-Komplexes aufweisen als wachsende Zellen, wurde postuliert, dass die rRNA-Synthese auf der Ebene der Transkriptionsinitiation über die Menge der Pol I-Rrn3p-Komplexe reguliert wird.
Während in Säugern die Komplexbildung über den Phosphorylierungsstatus und die Lokalisation des Rrn3 kontrolliert wird, scheint in S. cerevisiae ein anderer Mechanismus in die Regulation der Pol I-Transkription involviert zu sein. Wie in der vorliegenden Doktorarbeit erstmalig demonstriert werden konnte, wird bei einem durch Aminosäuredepletion oder Rapamycinbehandlung induzierten Wachstumsarrest ein Großteil des Hefe-Rrn3p vom 26S Proteasom degradiert. Um feststellen zu können, ob der Abbau des Rrn3p für die wachstumsabhängige Regulation der rRNA Synthese von Bedeutung ist, wurde zunächst ein Hefestamm analysiert, in dem das Rrn3p-Expressionsniveau künstlich variiert werden kann. Hierbei zeigte sich, dass die in wachsenden Hefen vorkommende Rrn3p-Menge die Syntheseleistung der Pol I beeinflusst. Außerdem wurde auf eine Mutante zurückgegriffen, die ein N-terminal verkürztes Rrn3p-Prot.A-Fusionsprotein exprimiert. Wie sich während dieser Promotion herausstellte, wird die trunkierte Rrn3p-Version unter ungünstigen Wachstumsbedingungen nicht abgebaut. Nach Aminosäuredepletion wurde in der Deletionsmutante die Menge der Pol I-Rrn3p-Komplexe zwar ebenfalls herunterreguliert, der Komplexverlust fiel allerdings wesentlich schwächer aus als im isogenen Wildtyp. Ferner wies der Stamm im wachstumsarretierten Zustand deutlich erhöhte Mengen rDNA-assoziierte Pol I auf. Zudem wurde in rapamycinbehandelten Zellen der Mutante eine verzögerte Repression der 35S prä-rRNA-Synthese beobachtet. Eine wachstumsabhängige Relokalisation des Rrn3p, wie sie für das Säugerhomologe beschrieben ist, wurde hingegen nicht festgestellt.
Somit tragen in wachstumsinhibierten S. cerevisiae-Zellen proteolytische Vorgänge zur Inaktivierung der rRNA-Synthese bei. Da bei einem Wachstumsarrest ein Großteil des Pol I-spezifischen Transkriptionsfaktors Rrn3p vom 26S-Proteasom degradiert wird, kommt es zu einem deutlichen Verlust an initiationskompetenten Pol I-Rrn3p-Komplexen. Wie in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden konnte, führt dies zu einer verminderten Rekrutierung des Enzyms an die rDNA und zu einer Herunterregulierung der Prä-rRNA-Synthese.
Die über den Rrn3p-Abbau vermittelte Repression der Pol I-Transkription scheint allerdings nicht allein dafür verantwortlich zu sein, dass bei Nährstoffmangel keine reifen rRNAs mehr synthetisiert werden. Denn in den rapamycinbehandelten Zellen der Deletionsmutante und des Wildtyps waren bereits nach kurzer Zeit fast keine rRNA Prozessierungsprodukte mehr nachweisbar, unabhängig davon wieviel 35S-rRNA noch hergestellt wurde. Angesichts dieser Beobachtung scheint die rRNA Synthese bei einem Wachstumsarrest vor allem auf der Ebene der rRNA-Prozessierung reprimiert zu werden, und nicht, wie bisher angenommen, auf der Ebene der Pol I-Initiation. Wie bereits erwähnt, wird die RP-Gen-Transkription in wachstumsarretierten Hefen ebenfalls inhibiert. Es ist möglich, dass wegen der deshalb ausbleibenden Assemblierung der ribosomalen Proteine an die rRNA-Vorläufer die Prozessierung der Prä-rRNA unter ungünstigen Wachstumsbedingungen zum Erliegen kommt. Demzufolge würde bei einem Wachstumsarrest die rRNA-Synthese entscheidend über die RP-Genexpression reguliert werden, und nicht, wie bisher vermutet, hauptsächlich über die Menge der initiationskompetenten Pol I-Rrn3p-Komplexe. Anhand der in dieser Doktorarbeit präsentierten Ergebnisse sollte das derzeit gültige Modell zur wachstumsabhängigen Regulation der rRNA Synthese kritisch überarbeitet werden.
Translation of the abstract (English)
The RNA polymerase I (Pol I)-specific transcription factor Rrn3p is required to initiate transcription at the rDNA promoter. The results presented in this work show that yeast Rrn3p is rapidly degraded by the proteasome under environmental stress conditions. In a mutant expressing a non-degradable version of Rrn3p, the initiation-active Pol I-Rrn3p complex is stabilized upon amino acid depletion ...
Translation of the abstract (English)
The RNA polymerase I (Pol I)-specific transcription factor Rrn3p is required to initiate transcription at the rDNA promoter. The results presented in this work show that yeast Rrn3p is rapidly degraded by the proteasome under environmental stress conditions. In a mutant expressing a non-degradable version of Rrn3p, the initiation-active Pol I-Rrn3p complex is stabilized upon amino acid depletion or rapamycin treatment, respectively. The higher amounts of Pol I-Rrn3p complex in the growth arrested mutant correlate with elevated levels of rDNA-associated RNA polymerase I and an attenuated downregulation of 35S rRNA synthesis. Thus, in growth arrested yeast cells degradation of Rrn3p contributes to downregulation of Pol I transcription at the initiation step. However, under unfavorable growth conditions rRNA synthesis is not only regulated on the level of 35S rRNA production. In both the mutant and the isogenic wild type strain rRNA processing is rapidly inhibited upon rapamycin treatment no matter how efficiently 35S rRNA is still synthesized. We suggest, that growth dependent regulation of rRNA synthesis occurs on several levels including initiation of Pol I transcription through degradation of Rrn3p and rRNA processing.
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