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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-9649
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.10732
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 24 April 2008 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Jürgen (PD Dr.) Stolz |
| Tag der Prüfung: | 10 April 2008 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Pflanzenwissenschaften > Lehrstuhl für Zellbiologie und Pflanzenphysiologie (Prof. Dr. Klaus Grasser) |
| Stichwörter / Keywords: | Membrantransport , Vitamin B2 , Vitamin B1 , Schizosaccharomyces pombe , Heubacillus , Corynebacterium glutamicum , Saccharomyces cerevisiae , Membranprotein , Transportprotein , Vitamintransport , membrane protein , transport protein , vitamin transport , riboflavin , thiamine |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 10732 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Aufgrund eines konservierten Riboswitch-Elements im 5�-Bereich der Gene ypaA aus B. subtilis und ribM aus C. glutamicum wurde vermutet, dass die von ihnen kodierten Proteine eine Funktion im Stoffwechsel von Riboflavin besitzen. Durch die Ergebnisse dieser Arbeit konnten YpaA und RibM als bakterielle Riboflavintransporter charakterisiert werden. Während YpaA, dessen C-Terminus cytoplasmatisch ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Aufgrund eines konservierten Riboswitch-Elements im 5�-Bereich der Gene ypaA aus B. subtilis und ribM aus C. glutamicum wurde vermutet, dass die von ihnen kodierten Proteine eine Funktion im Stoffwechsel von Riboflavin besitzen. Durch die Ergebnisse dieser Arbeit konnten YpaA und RibM als bakterielle Riboflavintransporter charakterisiert werden. Während YpaA, dessen C-Terminus cytoplasmatisch orientiert ist, mit fünf vorhergesagten TMDs zur BART (bile acid/arsenate/riboflavin transporter) Superfamilie gehört, ist RibM sehr homolog zur bakteriellen Familie der Nikotinamidribosid-Transporter PnuC. Die Deletion von ypaA führte zum Verlust, die Überexpression von ypaA dagegen zu einer stark erhöhten Aufnahme von Riboflavin und Roseoflavin. Sowohl die Transportaktivität einer B. subtilis Biosynthesemutante als auch die vorhandene Proteinmenge an YpaA hingen von der Riboflavinkonzentration im Medium ab. Im Gegensatz zu RibM war der Riboflavintransport über YpaA durch Protonophoren inhibierbar und nur in Gegenwart von Glucose nachweisbar, was dafür spricht, dass YpaA sein Substrat durch einen energiegekoppelten Prozess transportiert. Während ypaA nicht funktionell in Escherichia coli exprimiert werden konnte, vermittelte RibM in dem Gram-negativen Bakterium die spezifische und hoch-affine Aufnahme (Km-Wert = 11 µM) von Riboflavin und Roseoflavin. Dies ermöglichte einen experimentellen Ansatz, Flavoproteine mit nicht-natürlichen Flavin-Cofaktoren herzustellen. In E. coli konnte durch gleichzeitige Expression von ribM eine selektive Beladung mit Roseoflavin konnte für das Flavoprotein Dodecin erzielt werden. Damit ist ein wichtiger Schritt zur Etablierung eines Expressionssystems gelungen, das die Synthese von Flavoproteinen mit nicht-natürlichen Flavinanaloga in vivo erlaubt.
Mit dem Plasmamembranprotein Thi9 wurde in dieser Arbeit der erste Vertreter einer neuartigen Klasse von Thiamintransportern identifiziert, der keine Ähnlichkeit zu den bekannten Transportern aus Bakterien, der Hefe S. cerevisiae oder aus Säugern aufweist. Aufgrund der Homologie zu Permeasen für GABA, Choline, Polyamine oder basischen Aminosäuren aus S. cerevisiae wird es der ACT (amino acid/choline transporter) Familie innerhalb der APC (amino acid/polyamide/organocation) Superfamilie (TC 2.A.3.4) zugeordnet. Ebenso wie seine Homologen besitzt es zwölf TMDs, die es in der Plasmamembran verankern. Thi9 verfügt über eine hohe Affintiät (Km-Wert = 0,4 µM) und eng begrenzte Spezifität für Thiamin, das es energieabhängig und durch Protonensymport aufnimmt. Während die Thiazoleinheit ebenso gut von Thi9 transportiert wurde wie Thiamin selbst, wurde HMP nicht aufgenommen. Im Gegensatz zu den Thiaminanaloga Pyrithiamin und Oxythiamin waren die Substrate der homologen Proteine � GABA, Cholin, basische Aminosäuren oder positiv geladene Ionen � nicht in der Lage, die Thiaminaufnahme zu inhibieren. Die Transkription von thi9+ wurde durch die Zugabe von Thiamin, nicht aber von Pyridoxin, zum Medium sehr rasch reprimiert. Das bestehende Thi9 Protein in der Plasmamembran hingegen blieb stabil und unterlag keinem aktiven Abbau.
Neben Thi9 besitzt S. pombe mit Bsu1 über eine weitere Möglichkeit, Thiamin aus dem Medium aufzunehmen. Das bislang als Pyridoxintransporter beschriebene Protein Bsu1 war bei Überexpression ebenfalls in der Lage, den Wachstumsdefekt einer thiaminauxotrophen Bäckerhefemutante zu komplementieren.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Based on the regulation of the corresponding genes by a riboswitch mechanism, YpaA from Bacillus subtilis and RibM from Corynebacterium glutamicum have been predicted to be involved in flavin metabolism. In this work both proteins were characterized as bacterial transport proteins for riboflavin. YpaA, a member of the family of riboflavin transporters within the BART (bile ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Based on the regulation of the corresponding genes by a riboswitch mechanism, YpaA from Bacillus subtilis and RibM from Corynebacterium glutamicum have been predicted to be involved in flavin metabolism. In this work both proteins were characterized as bacterial transport proteins for riboflavin. YpaA, a member of the family of riboflavin transporters within the BART (bile acid/arsenate/riboflavin transporter) superfamily, is a plasma membrane protein with five transmembrane domains and a cytoplasmic C-terminus while RibM shows high homology to the bacterial PnuC family of nicotinamidribosid transporters. In B. subtilis, riboflavin uptake was increased when ypaA was overexpressed and abolished when ypaA was deleted. Riboflavin uptake activity and the abundance of the YpaA protein were also increased when riboflavin auxotrophic mutants were grown in limiting amounts of riboflavin. In contrast to RibM, YpaA-mediated riboflavin uptake was sensitive to protonophors and reduced in the absence of glucose, demonstrating that the protein requires metabolic energy for substrate translocation. While ypaA could not be functionally expressed in Escherichia coli, RibM conferred specific and high affinity transport of riboflavin (Km = 11 µM) and the toxic analog roseoflavin was also transported. This facilitated an experimental approach to generate flavoproteins with non-natural ligands. When expressed together with ribM in E. coli cells, the flavoprotein dodecin contained a high proportion of roseoflavin. This represents a first step to generate FMN- or FAD containing flavoproteins with modified ligands in vivo.
The plasmamembrane protein Thi9 from Schizosaccharomyces pombe represents a novel thiamine transporter, which shows no similarity to the characterized analogous proteins from bakers yeast or mammals. Due to its homology to permeases for gamma-aminobutyric acid (GABA), choline, polyamines or basic amino acids from Saccharomyces cerevisiae it is a distant member of the ACT (amino acid/choline transporter) family within the APC (amino acid/polyamide/organocation) superfamily (TC 2.A.3.4). Thi9 is a specific and high-affintiy transporter for thiamine (Km = 0,4 µM) which is accumulated by the cells in an energy-dependent process. While thiazole was also a substrate of Thi9, the HMP moiety of thiamine was not taken up by fission yeast. In contrast to the structural analogs pyrithiamine and oxythiamine, GABA, choline, basic amino acids or unrelated organocations did not interfere with thiamine uptake. Transcription of thi9+ was quickly repressed by the addition of thiamine but not by pyridoxine to the growth medium. The Thi9 protein, however, remained stable in the membrane and was not actively degraded.
S. pombe cells posses an alternative pathway for thiamine acquisition. Overexpression of bsu1+, the product of which was characterized as pyridoxine transporter, was able to improve the growth S. cerevisiae cells with defects in thiamine biosynthesis and transport.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 12:31
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