| License: Publishing license for publications including print on demand (1MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-9833
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.10757
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 5 August 2008 |
| Referee: | Karl (Prof. Dr.) Kunzelmann |
| Date of exam: | 29 April 2008 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Physiologie > Prof. Dr. Karl Kunzelmann |
| Keywords: | Equines Herpesvirus 1 , Gentransfer , Virusvektor , virales Vektorsystem , heterologes Prime/ Boost Verfahren , mukosale Immunantwort , Equine Herpesvirus 1 , viral vector system , gene transfer , heterologous prime/ boost , mucosal immune response |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 10757 |
Abstract (German)
Die Anwendung viraler Vektorsysteme für den heterologen Gentransfer ist stark limitiert durch Faktoren wie präexistierende Immunität, Pathogenität oder geringes immunogenes Potential. In der vorliegenden Arbeit wurde daher das Equine Herpesvirus Typ 1 (EHV-1) hinsichtlich seiner Eignung als neues virales Vektorsystem evaluiert. Das Virus infiziert effizient eine große Bandbreite eukaryontischer ...
Abstract (German)
Die Anwendung viraler Vektorsysteme für den heterologen Gentransfer ist stark limitiert durch Faktoren wie präexistierende Immunität, Pathogenität oder geringes immunogenes Potential. In der vorliegenden Arbeit wurde daher das Equine Herpesvirus Typ 1 (EHV-1) hinsichtlich seiner Eignung als neues virales Vektorsystem evaluiert. Das Virus infiziert effizient eine große Bandbreite eukaryontischer Zellen und lässt sich in vitro in kurzen Replikationszyklen hochtitrig vermehren. Während das Virus im Pferd respiratorische Erkrankungen und Aborte verursacht, deuten alle bislang gewonnenen Daten darauf hin, dass es im Menschen apathogen und in seiner Replikation in humanen Zellen stark beeinträchtigt ist. Aufgrund der extrem niedrigen Prävalenz von EHV-1 im Menschen, ist zudem mit präexistierender Immunität nicht zu rechnen. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass neutralisierende Antikörper, die gegen humane Herpesviren gerichtet sind, keine Kreuzreaktivität zu EHV-1 aufweisen.
Vom methodischen Standpunkt aus ermöglichen die Existenz eines EHV- Bacterial Artificial Chromosome (BAC) und das Verfahren der homologen RED-Rekombination eine schnelle und einfache Herstellung rekombinanter Viren. Auf diese Weise wurde im Rahmen dieser Arbeit ein breites Spektrum rekombinanter EHV-Konstrukte hergestellt, die nach Transduktion die eingebrachten Transgene wie z.B. unterschiedliche HIV-1 Antigene oder das grün fluoreszierende Protein (GFP) effizient exprimieren.
Im Verlauf der Arbeit wurden diese Konstrukte hinsichtlich ihres immunogenen Potentials im Mausmodell ausgetestet. Dabei ergab sich, dass bereits geringe Virusmengen in der Größenordnung von 104 infektiösen Einheiten nach systemischer oder intranasaler Applikation für die Induktion Transgen-spezifischer Immunantworten ausreichend sind. Als besonders vielversprechend zeigte sich die intranasale Verabreichung des Virus in Kombination mit einer systemisch applizierten Plasmid DNA-Immunisierung. Mit dieser heterologen Prime/ Boost-Strategie konnte neben einer verstärkten systemischen Transgen-spezifischen Immunantwort zusätzlich eine sehr gute Schleimhautimmunität induziert werden, die insbesondere hinsichtlich der Wirksamkeit eines HIV-Impfstoffes von großer Bedeutung ist.
Ein weiteres Augenmerk der Arbeit lag auf einer erhöhten Vektorsicherheit. Die Replikation des Virus ist in humanen Zellen zwar stark reduziert, aber nicht völlig unterbunden. Deshalb wurde eine Virusmutante erzeugt, in der der equine trans-induzierende Faktor (eTIF), ein wichtiges Tegumentprotein und verantwortlich für die Transaktivierung des einzigen immediate early Gens, deletiert wurde. Die eTIF-deletierten Viren infizieren in vitro effizient ein breites Spektrum unterschiedlicher eukaryontischer Zellen, jedoch konnte in humanen Zellen keine Produktion von Nachkommenviren mehr nachgewiesen werden. Gleichzeitig zeigen Experimente im Mausmodell, dass die guten immunologischen Eigenschaften des Virus bei Verwendung geeigneter heterologer Prime/ Boost Vakzinierungsstrategien auch in den eTIF-deletierten Mutanten erhalten bleiben.
Insgesamt sind die in der Arbeit gewonnenen Daten hinsichtlich eines Einsatzes des Equinen Herpesvirus als neues virales Vektorsystem vielversprechend. Aufgrund der guten Immunisierungsergebnisse, die mit heterologen Immunisierungsstrategien erzielt werden, ist das Virus ein aussichtsreicher Kandidat für Vakzineapplikationen. Besonders hebt sich dabei die gute Schleimhautimmunantwort hervor, die durch EHV hervorgerufen wird und gerade im Kontext einer schützenden HIV-Vakzine eine Schlüsselrolle einnimmt, weil dadurch Viren bereits an einer der Haupteintrittspforten abgefangen werden können. Gleichzeitig befürworten die sehr schwachen Transgen-spezifischen zellulären Immunantworten, die durch homologe Prime/ Boost-Applikation von UL48-deletiertem EHV hervorgerufen werden, auch den Einsatz des Virus für gentherapeutische Anwendungen. Durch seinen Tropismus für professionelle Antigen-präsentierende Zellen (Monocyten, B-Zellen, Dendriten) ist das Virus darüber hinaus auch für diagnostische Anwendungen, wie z.B. das Auslesen von T-Zell-Immunantworten, einsetzbar.
Translation of the abstract (English)
The use of common viral vector systems for heterologous gene transfer is often limited by factors like pre-existing immunity, pathogenicity or weak immunogenic potential. In this work we therefore investigated the potential of Equine Herpesvirus type 1 as a new viral vector system. The virus effectively infects a broad spectrum of different eukaryotic cells and can be grown to high titers in ...
Translation of the abstract (English)
The use of common viral vector systems for heterologous gene transfer is often limited by factors like pre-existing immunity, pathogenicity or weak immunogenic potential. In this work we therefore investigated the potential of Equine Herpesvirus type 1 as a new viral vector system. The virus effectively infects a broad spectrum of different eukaryotic cells and can be grown to high titers in vitro. Though the virus is known to cause respiratory distress and abortion in horses, all data currently available indicate that EHV-1 is apathogenic in humans and that its replication in human cells is severely impaired. In addition due to the extremely low prevalence of the virus in humans it can be assumed that the problem of pre-existing immunity should be of minor importance. Furthermore it is known that neutralizing antibodies directed against human herpesviruses show no crossreactivity to EHV-1.
From a methodical point of view cloning of EHV-1 as a bacterial artificial chromosome (BAC) and a RED-mediated homologue recombination technique enable quick and easy generation of recombinant virus. By this means a broad panel of recombinant EHV coding for a variety of different transgenes including different HIV-1 antigens and the green fluorescent protein (GFP) were generated within this work. It could be shown that the encoded transgenes were efficiently expressed upon infection of eukaryotic cells with recombinant virus.
During the course of this work the immunogenic potential of the viral constructs was investigated in a Balb/c mouse model. It could be shown that even low dosages of systemically or intranasally applicated virus (104 infectious units) are sufficient for induction of a transgene specific immune response. The most promising results were achieved by a heterologous prime/ boost strategy consisting of a systemic plasmid DNA priming and two nasal booster immunisations with recombinant EHV-1. This immunisation strategy did not only induce excellent transgene-specific systemic immune responses but could also evoke a good transgene-specific mucosal immune response which is of prime importance for the development a protective HIV-vaccine.
Another goal of this work was to improve the security features of EHV-1 to enhance its potential as a viral vector system. Though replication of EHV-1 is highly impaired in human cells it is not completely abolished. Therefore a viral mutant was generated in which the equine trans-inducing factor (eTIF) was deleted. This factor is an important tegument protein and essential transactivator of the only EHV-1 immediate early gene (IE).
Analysis of the eTIF-deleted virus showed that while infectivity and transgene expression were left unaffected no production of progenitor virus could be detected in human cells anymore. Furthermore the use of the eTIF-deleted virus in a heterologous prime/ boost vaccination strategy showed that the good immunological properties of EHV-1 in the mouse model stay unimpaired.
In conclusion our findings support the use of EHV-1 as a new viral vector system. The good immunisation results achieved by the use of heterologous immunisation strategies make the virus a promising candidate for vaccine applications. Thereby regarding the development of a protective HIV-vaccine especially the induction of a strong transgene-specific mucosal immune response by EHV-1 is of prime importance as the mucosa is the main entry site of HIV. Apart from its use for vaccination purposes the weak transgene-specific immune responses induced by homologous prime/ boost-applications of eTIF-deleted virus also promote the use of EHV-1 in gene therapy. Moreover, due to its tropism for antigen-presenting cells (monocytes, B cells and dendritic cells) EHV-1 could also be used as a diagnostic tool e. g. to measure T cell immune responses.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 12:26
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