The combination of several different approaches is required for the comprehensive analysis of all the small molecules in a biological system, termed metabolomics. Here, we present two different strategies towards this final goal. A capillary electrophoresis - mass spectrometry method was developed and validated for the quantitative analysis of negatively charged metabolites by making use of the ...
Zusammenfassung (Englisch)
The combination of several different approaches is required for the comprehensive analysis of all the small molecules in a biological system, termed metabolomics. Here, we present two different strategies towards this final goal. A capillary electrophoresis - mass spectrometry method was developed and validated for the quantitative analysis of negatively charged metabolites by making use of the high mass accuracy and the quantitation capabilities of a time-of-flight mass analyzer in combination with automated feature extraction and database search. The method was used to elucidate metabolic changes in the Escherichia coli deletion mutant UdhA-PntAB that lacks nicotinamide nucleotide transhydrogenase function, under both stationary and exponential growth conditions. Concomitant analyses with two different gas chromatography-mass spectrometry methods allowed not only cross-validation of the quantitative results obtained by the various methods, but also led to a more comprehensive coverage of the E. coli metabolome. In the second approach we introduced rapid resolution ion pair-liquid chromatography - tandem mass spectrometry for the analysis of the isotopomer distribution in intermediates of the upper and the lower part of the central carbon metabolism, including glycolysis, PPP, TCA, and related pathways, in cells grown in culture media supplemented with 1,2-13C2-glucose. Additionally, reliable quantification of metabolites was achieved by the use of stable-isotope labeled internal standards. The applicability of the method was tested by comparing isotopomer distributions in central carbon intermediates in the two Escherichia coli strains described above. We observed in the mutant strain the expected increase in carbon flux through the oxidative PPP in concordance with published gas chromatography � mass spectrometry data on the mass isotope distribution in proteinogenic amino acids. We also observed in the mutant a relative increase in carbon flux through the NADPH-generating isocitrate dehydrogenase reaction of the TCA cycle, while the carbon flux through the glyoxylate pathway was decreased in comparison to wild type E. coli. Further, absolute levels of TCA cycle intermediates were generally higher in the mutant than the wild type. Finally, the mutant also exhibited a decreased flux through the NADPH consuming methylglyoxal pathway, an offshoot of glycolysis, which was inferred indirectly from an imbalance of unlabeled and doubly labeled extracellular lactate. The data support the utility of RR-IP-LC-MS/MS in the rapid and simple screening for alterations in flux distributions in the central carbon metabolism. It does not require any prior information on the biological system of interest and, therefore, can be applied to any prokaryotic or eukaryotic cell.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Die umfassende Analyse aller kleinen Moleküle eines biologischen Systems, genannt Metabolomics, kann derzeit nur durch die Kombination von mehreren unterschiedlichen analytischen Methoden erfolgen. In der vorliegenden Arbeit werden zwei Strategien in diesem Kontext vorgestellt. Eine Methode basierend auf Kapillarelektrophorese � Massenspektrometrie wurde für die quantitative Analyse von ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Die umfassende Analyse aller kleinen Moleküle eines biologischen Systems, genannt Metabolomics, kann derzeit nur durch die Kombination von mehreren unterschiedlichen analytischen Methoden erfolgen. In der vorliegenden Arbeit werden zwei Strategien in diesem Kontext vorgestellt. Eine Methode basierend auf Kapillarelektrophorese � Massenspektrometrie wurde für die quantitative Analyse von anionischen Metaboliten entwickelt und validiert. Als besonders vorteilhaft stellte sich die Verwendung eines hochauflösenden Flugzeitmassenspektrometers dar, wodurch die robuste Quantifizierung von ausgewählten bekannten Metaboliten mit automatisierter Detektion von zusätzlichen potentiellen Metaboliten und anschließender Datenbanksuche verbunden werden konnte. Die Methode wurde zur Untersuchung von metabolischen Veränderungen unter verschiedenen Wachstumsbedingungen in der Escherichia coli Deletionsmutante UdhA-PntAB, in welcher beide Nikotinamidnukleotid-Transhydrogenasen fehlen, eingesetzt. Durch die gleich-zeitige Analyse der Proben mit zwei verschiedenen Gaschromatographie � Massenspektrometrie basierten Methoden, konnte zum einen eine Vergleichsprüfung der quantitativen Ergebnisse erfolgen, zum anderen konnte auch eine umfassendere Abdeckung des E. coli Metaboloms erzielt werden. Des weiteren wurde eine Methode basierend auf Ionenpaar � Flüssigkeits-chromatographie gekoppelt mit einem Tandemmassenspektrometer entwickelt und für die Analyse der Isotopomerenverteilung in Intermediaten des gesamten zentralen Kohlenstoffstoffwechsels, i.e. Glykolyse, PPP, TCA und davon abzweigende Stoffwechselwege, eingesetzt. Dafür wurden Zellen verwendet, welche in Nährmedien inkubiert wurden, die mit [1,2-13C2]Glukose supplementiert worden waren. Zusätzlich konnten mit dieser Methode ausgewählte Metaboliten mit Hilfe von isotopenmarkierten internen Standards zuverlässig und genau quantifiziert werden. Die Methode wurde auf ihre Anwendbarkeit getestet, indem die Isotopomerenverteilung innerhalb des zentralen Kohlenstoffstoffwechsels in den beiden oben genannten E. coli Stämmen gemessen wurde. In der Mutante konnte eine Verschiebung der Stoffwechselflüsse in Richtung des oxidativen PPP beobachtet werden, was sehr gut mit publizierten GC-MS Daten korrelierte. Außerdem wurde in der Mutante ein relativer Anstieg des Flusses durch den Isozitrat-Dehydrogenase katalysierten Teil des Zitratzyklus beobachtet, im Zuge dessen auch NADPH generiert wird, während der Fluss durch den Glyoxylatweg im Vergleich zum Wildtyp verringert war. Des weiteren wurden in der Mutante zumeist höhere Konzentrationen an Zitratzyklus-Intermediaten gefunden. Schließlich zeigte die Mutante zudem einen verringerten Fluss durch den Methylglyoxalweg, in welchem NADPH verbraucht wird und welcher einen Seitenweg zur Glykolyse darstellt. Diese Daten unterlegen die Eignung der entwickelten Methode als schnelle und einfache Strategie für das Screening von Veränderungen in den Flüssen des zentralen Kohlenstoffstoffwechsels. Man benötigt dafür keinerlei vorausgehende Informationen über das untersuchte biologische System, weshalb die Methode auf jede prokaryotische oder eukaryotische Zelle angewendet werden kann.
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