| Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen ohne Print on Demand (10MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-10849
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.10803
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 0 Dezember 2008 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Wolfgang (Prof. Dr.) Seufert |
| Tag der Prüfung: | 3 September 2008 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Cell Cycle Control > Prof. Dr. Wolfgang Seufert |
| Stichwörter / Keywords: | Mitose , Saccharomyces cerevisiae , Ribosomale DNS , Nucleolus , Interaktion , Zellzyklus , Regulation , Phosphatasen , Tof2 , Cdc14 , Net1 , Phosphatase , Condensin , mitotic exit , mitotic exit network (MEN) , Cdc fourteen early anaphase release (FEAR) |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 10803 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Die Phosphatase Cdc14 ist ein wichtiger Regulator der Mitose in der Hefe S. cerevisiae. Cdc14 gehört zur Familie der Ser/Thr Phosphatasen und ist bis zum Menschen konserviert. In S. cerevisiae ist Cdc14 essentiell für den Austritt aus der Mitose. Durch seine Phosphatase Aktivität wirkt Cdc14 den Phosphorylierungsereignissen der zyklinabhängigen Kinase Cdc28 entgegen und ist an deren Inhibition ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Die Phosphatase Cdc14 ist ein wichtiger Regulator der Mitose in der Hefe S. cerevisiae. Cdc14 gehört zur Familie der Ser/Thr Phosphatasen und ist bis zum Menschen konserviert. In S. cerevisiae ist Cdc14 essentiell für den Austritt aus der Mitose. Durch seine Phosphatase Aktivität wirkt Cdc14 den Phosphorylierungsereignissen der zyklinabhängigen Kinase Cdc28 entgegen und ist an deren Inhibition und dem Abbau mitotischer Zykline am Ende der Mitose beteiligt. Weitere Ereignisse, die am Ende der Mitose von Cdc14 vermittelt werden, sind die Stabilisierung der Spindel, die Positionierung des Zellkerns, die Trennung der rDNA und die Einleitung der Zytokinese. Die Aktivität der Phosphatase muss daher für einen korrekten Ablauf des Zellteilungszyklus streng reguliert werden. Cdc14 wird bis zur Metaphase über den N-terminalen Teil von Net1 im Nukleolus verankert und somit inhibiert. Jüngste Studien haben gezeigt, dass Cdc14 und Net1 Teil eines größeren Netzwerks nukleolarer Proteine darstellen, das auch das Net1-verwandte Protein Tof2 enthält. Tof2 ist am regionspezifischen rDNA-silencing beteiligt, seine genaue zelluläre und molekulare Funktion ist jedoch noch weitestgehend unverstanden. Aufgrund der 30%-igen Sequenzidentität des N-terminalen Bereichs von Tof2 zu dem für die Cdc14 Verankerung und Inhibition verantwortlichen N-terminalen Bereich von Net1 sollte eine mögliche Verbindung von Tof2 und Cdc14 analysiert werden.
Über indirekte Immunfluoreszenz konnte gezeigt werden, dass Tof2 während des gesamten Zellteilungszyklus im Nukleolus lokalisiert. Weiterhin machten in vivo Interaktionsstudien deutlich, dass die nukleolaren Proteine Tof2, Cdc14 und Net1 in einem gemeinsamen Komplex vorliegen und der N-terminale Teil von Tof2 notwendig und hinreichend ist für die Assoziation mit der Phosphatase. In einer in vitro Interaktionsstudie war es außerdem möglich, die direkte Bindung von Cdc14 an den N-terminalen Bereich von Tof2 nachzuweisen. Aufgrund der Ähnlichkeiten von Tof2 und Net1 innerhalb ihrer N-terminalen Sequenzen und der Interaktion mit Cdc14, wurde auf die Ähnlichkeit ihrer Funktionen in vitro und in vivo getestet. In vitro Messungen der Phosphatase Aktivität zeigten, dass Tof2 anders als Net1 kein Inhibitor der Phosphatase Cdc14 ist, sondern deren Aktivität stimuliert. Auch in vivo verhielt sich Tof2 nicht wie ein Inhibitor der Phosphatase, im Unterschied zu Net1 unterstützt Tof2 die biologische Funktion von Cdc14.
Analysen einer tof2-Deletionsmutante ergaben eine größtenteils normale Progression durch den Zellteilungszyklus mit einer marginalen Verzögerung der Anaphase/Telophase und Zytokinese. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Nukleolustrennung in der Deletionsmutante beeinträchtigt ist. Lokalisationsstudien des etablierten nukleolaren Markers Net1 in einer asynchronen Kultur von tof2-Deletionsmutanten machten deutlich, dass über 50% der analysierten Anaphase Zellen eine asymmetrische Verteilung des Nukleolus bzw. nukleolare Brücken zwischen den bereits weit voneinander getrennten Kernen zeigten. Eine zeitliche Abschätzung ergab, dass Mutanten, die eine Deletion von TOF2 aufweisen, circa 50 Minuten benötigten, um ihre rDNA komplett zu trennen, während sich diese Zeit bei dem Kontrollstamm auf 25 Minuten berechnen ließ. Analysen synchroner Kulturen bestätigten die verzögerte Trennung des Nukleolus in der tof2-Deletionsmutante. Der Prozess der Kompaktierung und Trennung der rDNA wird durch Condensin vermittelt, das in einer Cdc14-abhängigen Weise während der Anaphase an der rDNA lokalisiert. Diese nukleolare Lokalisation des heteropentameren Condensin-Komplexes während der Anaphase wurde über indirekte Immunfluoreszenz der Condensinuntereinheit Smc4 untersucht. Es wurde deutlich, dass Smc4 in der tof2-Deletionsmutante während der Anaphase nicht nur auf den Nukleolus beschränkt ist sondern auch im Zellkern und Nukleoplasma lokalisiert.
All diese Daten zusammengenommen weisen darauf hin, dass Tof2 Cdc14 in vivo unterstützt und zwar dahingehend, dass es die Rekrutierung von Condensin an die rDNA während der Anaphase erleichtert und somit zu einer korrekten Trennung der rDNA beiträgt. Dies könnte dadurch bewerkstelligt werden, dass Tof2, das auch während der Anaphase im Nukleolus lokalisiert, einen Pool von aktivem Cdc14 in dieser Phase des Zellzyklus an der rDNA zurückhält. Dadurch wäre es Cdc14 möglich auf bestimmte Zielproteine an der rDNA zu wirken, um diese auf eine erfolgreiche Bindung von Condensin vorzubereiten.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
The phosphatase Cdc14 is an important regulator of mitosis in S. cerevisisae. Cdc14 belongs to the family of dual specifity Ser/Thr phosphatases and is conserved from yeast to humans. In S. cereviasiae Cdc14 is essential for mitotic exit. Cdc14 antagonizes cyclin dependent kinases and promotes multiple post-metaphase events including spindle stabilization, nuclear positioning, rDNA separation and ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
The phosphatase Cdc14 is an important regulator of mitosis in S. cerevisisae. Cdc14 belongs to the family of dual specifity Ser/Thr phosphatases and is conserved from yeast to humans. In S. cereviasiae Cdc14 is essential for mitotic exit. Cdc14 antagonizes cyclin dependent kinases and promotes multiple post-metaphase events including spindle stabilization, nuclear positioning, rDNA separation and cytokinesis. To guarantee a correct progression of the cell cycle, Cdc14 activity needs to be strictly regulated. From G1 to metaphase the phosphatase associates with the N-terminal part of Net1, which restricts it to the nucleolus thus inhibiting its proper function. Recently, Cdc14 and Net1 were shown to be part of a larger network of nucleolar proteins containing also the Net1 related protein Tof2. The latter was linked to region specific rDNA-silencing, however its cellular and molecular functions remain still elusive. Given that the N-terminal parts of Tof2 and Net1 share 30% sequence identity, it seemed possible that Tof2 associates with Cdc14 similar to the interaction of Net1 with Cdc14.
By indirect immunofluorescence Tof2 was localized to the nucleolus throughout the cell division cycle. Furthermore, in vivo interaction studies revealed a complex of the nucleolar proteins Tof2, Cdc14 and Net1. Here, it was shown that the N-terminal part of Tof2 is necessary and sufficient for the associtation with the phosphatase. Analysis of protein-protein interaction in vitro indicated that Cdc14 bound to the N-terminal part of Tof2 directly. Inspired by the regulating influence of the N-terminal part of Net1 on Cdc14, the observed interaction of Tof2 and Cdc14 was analysed for similar features. Using an in vitro phosphatase assay it was shown that in contrast to the Cdc14 inhibition by Net1, Tof2 stimulates the phosphatase activity of the protein. Subsequent in vivo experiments also supported the notion that Tof2 is not an inhibitor but rather an activator of Cdc14.
The tof2-deletion mutant exhibited predominantly normal cell cycle progression with little effect on anaphase/telophase and cytokinesis. Further analysis showed that the deletion of TOF2 delayed rDNA segregation. When the separation of the nucleolar marker Net1 was tested in asynchronous cultures of tof2-deletion mutants it became apparent that more than 50% of the analysed anaphase cells contained an asymmetric separated nucleolus or nucleolar bridges between already separated nuclei. Estimation of the time needed to complete rDNA separation yielded a time span of 50 minutes for the tof2-deletion mutant compared to 25 minutes for the wild type control. Experiments with synchronous cultures of tof2-deletion mutants supported the delayed separation of the nucleolus. Condensin, which localizes to the rDNA in a Cdc14 dependent manner during anaphase, mediates the compaction and separation of rDNA. The nucleolar localization pattern of the heteropentameric condensin complex during anaphase was examined using indirect immunofluorescence microscopy of the condensin subunit Smc4. This test revealed that Smc4 in contrast to wild type cells is not restricted to the nucleolus of tof2-deletion mutants but localizes to the nucleus and the nucleoplasm in anaphase.
In conclusion, these results suggest a Cdc14 supporting role for Tof2 in vivo, facilitating the allocation of condensin to the rDNA during anaphase and by this means contributing to a correct separation of the rDNA. This could be possibly achieved by Tof2, which localises to the nucleolus throughout the cell division cycle retaining a pool of active Cdc14 at the rDNA during anaphase. This provides a mechanism by which Cdc14 may act on critical target proteins in the immediate vicinity of the rDNA locus.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 12:21
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