| License: Publishing license for publications excluding print on demand (22MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-11012
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.10804
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 0 December 2008 |
| Referee: | Ralph (Prof. Dr.) Witzgall |
| Date of exam: | 28 August 2008 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Anatomie > Lehrstuhl für Molekulare und zelluläre Anatomie > Prof. Dr. Ralph Witzgall |
| Keywords: | Immuncytochemie , Fluoreszenzspektroskopie , Dissoziationskonstante , Intrazellulärer Transport , Zystenniere , Membranproteine , Polycystin-2 , Membranprotein , immunocytochemistry , fluorescence spectroscopy , intracellular trafficking , Polycystin-2 , membrane protein |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 10804 |
Abstract (German)
PKD2 ist eines der Gene, die im Falle einer Mutation zur Entstehung der autosomal dominant vererbten polyzystischen Nierenerkrankung (ADPKD) führen. PKD2 kodiert für ein 968 Aminosäuren umfassendes Membranprotein (PC2), das 6 Transmembrandomänen besitzen soll, wobei der N- und C-Terminus ins Zytoplasma ragen. PC2 fungiert als nicht selektiver Kationen-Kanal in der Membran des ER bzw. des Ziliums. ...
Abstract (German)
PKD2 ist eines der Gene, die im Falle einer Mutation zur Entstehung der autosomal dominant vererbten polyzystischen Nierenerkrankung (ADPKD) führen. PKD2 kodiert für ein 968 Aminosäuren umfassendes Membranprotein (PC2), das 6 Transmembrandomänen besitzen soll, wobei der N- und C-Terminus ins Zytoplasma ragen. PC2 fungiert als nicht selektiver Kationen-Kanal in der Membran des ER bzw. des Ziliums. In manchen Zelllinien wird jedoch z.T. auch eine Plasmamembranlokalisation des Volllängen-Proteins berichtet. Bisher sind noch keine Hot-Spots für Mutationen bekannt, so dass noch nicht verstanden ist, wie Mutationen in PKD2 zu ADPKD führen. Daher sollte die Proteinstruktur über Topologie-Studien und NMR-Analysen der C-terminalen Domäne, die für die meisten Protein-Interaktionen von PC2 von Nöten ist, charakterisiert werden. Bindungsstudien mit Interaktionspartnern sollten helfen, die physiologische Relevanz dieser Wechselwirkungen besser beurteilen zu können. Schließlich sollte ein Exportmotiv charakterisiert werden, das zum besseren Verständnis der subzellulären Lokalisation von PC2 beitragen sollte.
Um die Orientierung der postulierten Schleifendomänen sowie des N- und C-Terminus zu überprüfen, wurde zunächst eine immunzytochemische Studie mit Polycystin-2-Konstrukten durchgeführt, die in den jeweiligen Schleifendomänen abgeschnitten waren und ein C-terminales Antikörper-Epitop trugen. Die so erhaltenen Daten stehen in Einklang zu dem entworfenen Modell und konnten durch Protease-protection-Assays mit Mikrosomenpräparationen bestätigt werden.
Die ER-Retention von PC2-Versionen mit Abbrüchen in Schleifendomäne 1-3 und die Translokation von PC2-Versionen mit Abbrüchen in Schleifendomäne 4 und 5 zur Plasmamembran deuteten auf die Existenz eines Exportmotivs hin. Durch Alanin-Scanning-Mutagenesestudien in Verbindung mit Biotinylierungs-Assays konnte das Motiv auf 6 Aminosäuren (KLFKFI, AS 572-577) in Schleifendomäne 4 eingegrenzt werden. Die identifizierte Aminosäuresequenz scheint die spezifische Lokalisation von PC2 in der somatischen Plasmamembran zu ermöglichen, wobei einem Lysin-Rest (AS 572) und einem Phenylalanin-Rest (AS 576) eine besondere Rolle beim Export zukommt. Dieser Aspekt legt nahe, dass PC2 auf zwei unabhängigen Wegen zur ziliären bzw. somatischen Plasmamembran gelangt, wobei sich diese vermutlich im Golgi-Apparat trennen, da PC2 und eine (plasmamembranständige) C-terminale Deletionsmutante in Gegenwart von entsprechenden �Transport-Inhibitoren� nicht mehr ins Zilium gelangen. Endo H-Assays deuten an, dass es sich dabei um das Cis-Golgi-Kompartiment handelt.
Für die strukturelle Charakterisierung des C-Terminus von PC2 über NMR wurde dieser zweigeteilt (AS 680-796 und AS 797-968) und die entsprechenden Peptide rekombinant hergestellt. Es zeigte sich, dass das größere (AS 797-968) der beiden Peptide homomere Interaktionen eingeht und HSQC-Spektren nach zu urteilen größtenteils unstrukturiert vorliegt. Die HSQC-Spektren des kleineren (AS 680-796) Peptides offenbarten, dass dieses erst spezifisch durch Zugabe von Calcium strukturiert wird, wobei das Peptid dann vornehmlich in Form von alpha-Helices organisiert ist. Während Fluoreszenzspektroskopiemessungen den Hinweis auf ein C-terminales EF-Hand-Motiv (Kd-Wert: 70-90 µM) lieferten, deuteten 1D-Protonenspektren an, dass ein paarweise angeordnetes Helix-Loop-Helix-Motiv des Peptides ein Calcium-spezifisches, sequentiell kooperatives EF-Hand-Paar bildet (Kd-Werte: 161 ± 36 µM und 51 ± 4 µM für N- und C-term. Motiv).
Für die Bestimmung der Bindungsparameter der Interaktionen von PC2 mit PIGEA-14 und PC1 über Quarzmikrowaagetechnik wurden C-terminal His-fusionierte Interaktionsdomänen der Bindepartner rekombinant hergestellt, auf einer Nickel-Lipid-Membran immobilisiert und im Anschluss mit dem rekombinant hergestellten C-Terminus von PC2 inkubiert. Für die Wechselwirkung von PC2 mit PC1 bzw. PIGEA-14 ergaben sich Kd-Werte von 46 ± 13 nM bzw. 146 ± 35 nM.
Die Kd-Werte der Interaktionen des C-Terminus von PC2 mit PC1, PIGEA-14 und Calcium sprechen somit für deren physiologische Relevanz. Weiterhin besitzt PC2 nachweislich 6 Transmembrandomänen, wobei die N- und C-Termini zytoplasmatisch orientiert sind. Die Identifizierung eines Exportmotivs in Schleife 4 könnte schließlich die in verschiedenen Zelllinien beobachtete unterschiedliche subzelluläre Lokalisation von PC2 erklären. Somit wurde im Rahmen dieser Arbeit sowohl ein Beitrag zur strukturellen als auch zur funktionellen Charakterisierung von PC2 geleistet. Dies wiederum könnte helfen zu verstehen, inwiefern Mutationen im PKD2-Gen zum Ausbruch von ADPKD führen.
Translation of the abstract (English)
PKD2 is one of the genes involved in autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD). It encodes a 968 amino acid long membrane protein polycystin-2 (PC2) with 6 transmembrane helices. PC2 functions as a non selective cation channel in the membrane of the endoplasmic reticulum (ER) and the primary cilium. PC2 was also reported at the somatic plasma membrane. In the absence of hot spot ...
Translation of the abstract (English)
PKD2 is one of the genes involved in autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD). It encodes a 968 amino acid long membrane protein polycystin-2 (PC2) with 6 transmembrane helices. PC2 functions as a non selective cation channel in the membrane of the endoplasmic reticulum (ER) and the primary cilium. PC2 was also reported at the somatic plasma membrane. In the absence of hot spot mutations, it is still unknown how mutations within PKD2 lead to polycystic kidney disease. A better characterization of PC2 structure and cellular trafficking might bring light into its function and its implication in ADPKD. This Doctoral work aimed at the elucidation of PC2 structure through topology and NMR studies, and at the characterization of PC2 binding to several interaction partners.
Elucidation of PC2 topology was performed using an immunocytochemical approach and protease protection assays from cells transiently expressing PC2 constructs truncated in the respective postulated loop domains and fused to a C-terminal HA epitope. Our data demonstrated that PC2 N- and C-termini as well as loop domains 2 and 4 are facing toward the cytoplasm, while PC2 loop domains 1, 3 and 5 are exposed to the ER lumen or extracellular space, therefore confirming PC2 predicted topology.
Furthermore, the ER-retention of PC2 proteins truncated within loop domains 1-3 and the plasma membrane translocation of PC2 proteins truncated within loop domains 4 and 5 suggested the unexpected presence of a plasma membrane export signal. Alanine-scanning mutagenesis and biotinylation-assays led to the identification of a 6 amino acid export motif between positions 572 and 577 (KLFKFI) within PC2 loop domain 4. A lysine residue (amino acid 572) and a phenylalanine residue (amino acid 576) are essential for its function as an export motif. Interestingly, this export signal is not involved in cilium trafficking, and is thus specific for PC2 somatic plasma membrane localization. These data therefore suggest the existence of two independent trafficking pathways to the ciliary and the somatic plasma membrane. The use of �trafficking inhibitors� and Endo H assays led to the proposition that the two pathways separate in the cis-golgi compartment. The identification of an export motif in loop domain 4 might explain the different subcellular localizations of PC2 reported in distinct cell lines.
The structure of the C-terminal domain of PC2 (amino acids 680-968), which is involved in multiple protein interactions (for instance with PIGEA-14 and PC1), was characterized by NMR. His-tagged peptides of amino acid regions 680-796 and 797-968 of PC2 were recombinantly expressed and affinity purified. HSQC spectra revealed that peptide 797-968 is barely structured and tends to form homomers, while peptide 680-796 is organized in alpha-helices in the presence of calcium. Whereas fluorescence spectroscopy measurements suggested the existence of a C-terminal EF-hand motif (Kd -value: 70-90 µM), 1 D proton-spectra favoured the presence of a paired helix-loop-helix motif which forms a calcium specific, sequential cooperative EF-hand pair (Kd-values: 161 ± 36 µM and 51 ± 4 µM for the N- and C-terminal motif).
To characterize the binding parameters of interaction between the C-terminal domain of PC2 and PIGEA-14 or PC1, recombinantly expressed His-tagged binding domains of either PIGEA-14 or PC1 were immobilized on a nickel-lipid layer and interaction with a recombinant form of the C-terminus of PC2 was evaluated by quartz microbalance. Kd-values of 46 ± 13 nM and 146 ± 35 nM were obtained for the interaction of PC2 with PC1 and PIGEA-14 respectively. The Kd-values for the interactions of the C-terminal domain of PC2 with PC1, PIGEA-14 and calcium support the physiological relevance of these interactions.
Altogether, this work led to the determination of PC2 topology, the identification of a novel plasma membrane export signal and the structural characterization of PC2 C-terminus protein interaction and calcium binding domains. This work represents a major contribution to the structural and functional characterization of polycystin-2, leading in turn to a better understanding of PC2 implication in ADPKD.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 12:21
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