Determination of DNA via Resonance Light Scattering technique using new probes derived from ruthenium ligands complexes and investigation of their binding mode

URN to cite this document:: urn:nbn:de:bvb:355-opus-11314
DOI to cite this document:: 10.5283/epub.12118

Burger, Doris Marianne

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Date of publication of this fulltext: 25 Feb 2009 15:24

Details

Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Open Access Type:	Primary Publication
Date:	24 February 2009
Referee:	Otto S. (Prof. Dr.) Wolfbeis
Date of exam:	2 February 2009
Institutions:	Chemistry and Pharmacy > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik > Chemo- und Biosensorik (Prof. Antje J. Bäumner, formerly Prof. Wolfbeis)
Keywords:	Rutheniumkomplexe , DNS-Bindung , DNS , Konzentration , Lichtstreuung , Fluoreszenzspektroskopie , Resonance Light Scattering , Resonance Light Scattering
Dewey Decimal Classification:	500 Science > 540 Chemistry & allied sciences
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	12118

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Abstract (English)

Abstract (English)

This thesis describes the synthesis of DNA probes derived from ruthenium ligand
complexes (RLCs). The biding mode of those RLCs to DNA was investigated and the
concentration of nucleic acid determined via the Resonance Light Scattering (RLS) technique.
Chapter 1 gives a short overview of the use on ruthenium complexes and their
advantages over organic dyes. There, the luminescence emission mechanism of ruthenium
ligand complexes is explained in detail. The three possible binding modes to DNA are
described.
Chapter 2 describes the mainstream theory of the RLS technique by Pasternack et al..
Since the introduction and its proof as valuable tool in analytical chemistry was made, there
were a large number of further developments. The development of various techniques
including the total internal reflected resonance light scattering (TIR-RLS) and backscattering
light (BSL), surface enhanced light scattering (SELS), resonance light scattering imaging
(RLSI), flow injection resonance light scattering (FI-RLS) and wavelength ratiometric RLS
technique (WRRLS) as well as the RLS particles are discussed.
In Chapter 3 the binding modes of the RLC derived probes to DNA was investigated.
Absorption and fluorescence spectra as well as polarization and melting studies of the probes
were performed in absence and presence of DNA resulting in the conclusion that all probes
bind to DNA in an intercalative mode. Viscosity measurements, the most critical binding test,
especially support this conclusion.
Chapter 4 presents the determination of DNA via RLS technique using the newly
designed RLCs. The optimal conditions for the assay were determined. The probe 2b proved
to be best because the assay could be performed at neutral pH. The optimal pH using probe 1
and 2a was pH 3. The pH optimum lies in the basic range for the other dinuclear RLCs. The
LOD of 2b was calculated to be 1.6 ng mL-1 for ct-DNA and 2.7 ng mL-1 for fs-DNA with a
wide linear range of 30 - 1800 ng mL-1 under optimum conditions. The method presented here
does not require surfactants and can be performed under neutral pH conditions. The low
LODs of this assay are obtained in a very simple way and are definitely comparable to other
RLS based methods, but also to well established fluorometric methods. Hence, the RLS assay
represents a valuable tool for DNA determination.
Chapter 5 describes a description of the synthetic pathways and purification of the
ruthenium complexes with yields in the range of 20- 30 % used in chapter 3 and 4. The proof
of structure and purity was provided by 1H NMR data.

Translation of the abstract (German)

Diese Arbeit beschreibt die Synthese von DNA Sonden, die sich von
Rutheniumligandenkomplexen (RLC) ableiten. Die Bindungseigenschaften dieser RLCs
wurden untersucht und Konzentration an DNA mittels der Resonanzlichtstreuung (RLS)
bestimmt.
Kapitel 1 beschreibt den Mechanismus auf dem die Lumineszenz der RLCs beruht,
sowie deren Vorteile gegenüber organischen Farbstoffen bezogen auf ihre chemischen und
photochemischen Eigenschaften. Des weiteren werden die drei möglichen kovalenten
Bindungen zu DNA gezeigt und ein Überblick über die vielfältigen Anwendungsmöglichkeiten
von RLCs gegeben.
Kapitel 2 beschreibt die am weitesten verbreitete Theorie der RLS Technik nach
Pasternack et al. Seit der Einführung der RLS Technik 1993, hat sie sich als ein wertvolles
Werkzeug in der analytischen Chemie erwiesen. Eine große Anzahl von Weiterentwicklungen
folgten in den nächsten Jahren, unter anderem die Total Internal Reflected Resonance Light
Scattering Technik (TIR-RLS), die Backscattering Light Technik (BSL), die Surface
Enhanced Light Scattering Technik(SELS), die Resonance Light Scattering Imaging Technik
(RLSI), die Flow Injection Resonance Light Scattering Technik (FIA-RLS) und die
Wavelength Ratiometric RLS Technik (WR-RLS) sowie die Entwicklung von RLS Partikeln
Die genannten Techniken werden im Einzelnen beschrieben.
In Kapitel 3 werden die Bindungseigenschaften der in dieser Arbeit synthetisierten
RLCs (siehe Kapitel 5) mit DNA untersucht. Dafür wurden Absorptions- und
Fluoreszenzspektren aufgenommen, sowie Polarisationsmessungen und Schmelzkurven in
An- und Abwesenheit von DNA durchgeführt. Die Ergebnisse der Messungen lassen darauf
schließen, daß sich die Sonden in die DNA einlagern. Besonders die Viskositätsmessungen,
der kritischste Test, unterstreichen diese Schlußfolgerung.
Kapitel 4 zeigt die Bestimmung von DNA Konzentrationen via Resonanzlichtstreuung
mittels RLCs deren Synthese in Kapitel 5 beschriebenen wird. Die optimalen Bedingungen
des Assays wurden ermittelt, wobei sich die Sonde 2b als die am besten geeignete
herausstellte. In diesem Falle konnte der Assay unter neutralen Bedingungen durchgeführt
werden. Dagegen liegt bei den Proben 1 und 2a der optimale pH im sauren; der der Sonden
2c - e im basischen Bereich. Unter optimalen Bedingungen, d.h. pH 7 und einer
Konzentration von 2b von 1 µM, konnte eine Nachweisgrenze für ct-DNA von 1.6 ng mL-1
und von 2.7 ng mL-1 für fs-DNA bestimmt werden. Der lineare Bereich erstreckt sich von 30
bis 1800 ng mL-1. Die hier präsentierte Methode benötigt keine Zusätze ( in der Regel Tenside
wie CTMAB) und kann unter neutralen pH durchgeführt werden. Mit dieser einfachen
Methode können niedrige Nachweisgrenzen erreicht werden, die mit anderen auf RLS
Technik basierenden, aber auch mit bereits gut etablierten fluorimetrischen Methoden
vergleichbar sind. Deswegen stellt dieser RLS Assay ein wertvolles Werkzeug zur
Bestimmung von DNA.
Kapitel 5 beschreibt die Synthese und Reinigung der in Kapitel 3 und 4 verwendeten
RLC. Die Ausbeuten liegen zwischen 20 und 30 %. Die Struktur wurde durch 1H NMR
Spektroskopie belegt.

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