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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-10258
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.12131
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 23 Juli 2009 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Hans Robert (Prof. Dr. Dr.) Kalbitzer |
| Tag der Prüfung: | 10 Juli 2008 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Dr. Hans Robert Kalbitzer |
| Stichwörter / Keywords: | Magnetische Kernresonanz , Protein HPr , Wirkstoff-Rezeptor-Bindung , Bindestelle , NMR-Spektroskopie , Röntgenstrukturanalyse , NMR , Pparg , HPr I14A , NMR , Pparg , HPr I14A , high-pressure |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 12131 |
Zusammenfassung (Deutsch)
In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Projekte durchgeführt. Zum einen wurde die Struktur der Ligandbindedomäne (LBD) von PPARg (Peroxisom-Proliferatoraktivierter Rezeptor gamma) mithilfe der NMR bestimmt und zum anderen die schon existierende Hochdruck-NMR-Apparatur weiterentwickelt und zur Untersuchung von HPr I14A, einer Mutante von HPr (histidine containing protein) von S. carnosus, ...
Zusammenfassung (Deutsch)
In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Projekte durchgeführt. Zum einen wurde die Struktur der Ligandbindedomäne (LBD) von PPARg (Peroxisom-Proliferatoraktivierter Rezeptor gamma) mithilfe der NMR bestimmt und zum anderen die schon existierende Hochdruck-NMR-Apparatur weiterentwickelt und zur Untersuchung von HPr I14A, einer Mutante von HPr (histidine containing protein) von S. carnosus, verwendet. Strukturen von PPARg-LBD sind bis dato nur durch die Methode der Röntgenbeugung bestimmt worden. Um eine Struktur in nativer Umgebung zu erhalten, wurde die Ligandbindedomäne von PPARg mithilfe der NMR in Ab- und Anwesenheit des Liganden Rosiglitazon untersucht. In Abwesenheit des Liganden sind sie NMR-Spektren von PPARg austauschverbreitert und von so geringer Qualität, dass eine NMR-Strukturbestimmung nicht möglich ist. Nach Bindung von Rosiglitazon nimmt die Qualität der Spektren durch eine Verringerung der Linienbreite beträchtlich zu, so dass ca. 90 % der erwarteten Signale detektierbar werden. Für die Strukturrechnungen wurden 2352 Abstandsinformationen (gewonnen aus NOESY-Spektren), 439 Winkelinformationen (mithilfe des Programmes TALOS) und 225 Wasserstoffbrückeninformationen (entnommen aus den Röntgenstrukturen) verwendet. Eine Überlagerung der zehn energieärmsten Strukturen, von 1024 gerechneten, ergab für das Rückgrat einen RMSD von 0,179 nm und für alle Atome einen RMSD von 0,249 nm. Eine Verbesserung der Struktur konnte mithilfe einer Strukturverfeinerung in Wasser erreicht werden, welche die Interaktion zwischen Protein und Lösung berücksichtigt. Diese Verbesserung konnte vor allem in den Werten der Diederwinkel nachgewiesen werden. Um die NMR-Struktur weiter zu verbessern, wurde der in Regensburg entwickelte ISIC-Algorithmus eingesetzt, mit dessen Hilfe Informationen aus der Röntgenstruktur verwendet werden konnten. Durch die Anwendung dieses Algorithmus konnte eine in allen Bereichen gut definierte Struktur erhalten werden. Sowohl der RMSD (0,0189 nm für das Rückgrat) als auch die Diederwinkel (99,5 % in den erlaubten Bereichen des Ramachandran-Plotes) zeigten eine deutliche Verbesserung. Die aus der Literatur bekannten Röntgenstrukturen von freiem und ligandierten PPARg-LBD unterscheiden sich vor allem durch die Stellung der C-terminalen Helix H12. In der Struktur von PPARg-LBD, die mithilfe der NMR ermittelt wurde, nimmt diese Helix eine besondere Position ein: Sie befindet sich zwischen den beiden Positionen der Röntgenstruktur.
Im Laufe dieser Arbeit wurden an den Hochdruckanlagen Umbauten und Weiterentwicklungen vorgenommen, um die Qualität der Anlagen zu verbessern. Diese betrafen u. a. den Berstschutz, den Autoklaven, die Behandlung der Quarz-Hochdruckzellen und Methoden zur Entlüftung der Anlagen. Durch diese Umbauten konnten sowohl die Sicherheit als auch die Handhabung der Anlagen gesteigert werden. Neben den statischen Druckuntersuchungen wurden erste Experimente
mit einer NMR-Drucksprunganlage durchgeführt.
Für Hochdruckmessungen wurde die Mutante von HPr I14A verwendet. Diese zeigte eine fast vollständige Denaturierung bei einem Druck von 2000 bar bei 318 K. Zusätzlich konnte eine Kältedenaturierung für HPr I14A bei 278 K und Normaldruck festgestellt werden. Bei 278 K und Normaldruck verschwindet in den Spektren das Signal der Referenzsubstanz DSS, was bei höheren Temperaturen gut beobachtbar ist. Dies legt nahe, dass im thermischen Gleichgewicht DSS in die durch die Mutation erzeugte Kavität bindet. Ein ähnliches Verhalten konnte bei der Druckreihe bei 278 K bis 200 MPa festgestellt werden. Auch hier ist ein scharfes DSS-Signal bei 200 MPa zu sehen. Aus den experimentellen Daten konnte die Gleichgewichtskonstante K für das Gleichgewicht zwischen nativ gefalteten und denaturierten Protein in Abhängigkeit von Druck und Temperatur bestimmt werden. Eine Anpassung der experimentellen Daten an ein Zweizustandsmodel erlaubte die Bestimmung der Änderung der freien Enthalpie G0, der Entropie S0, Wärmekapazität Cp, des molaren partiellen Volumens V 0, des thermischen Ausdehnungskoeffizienten alpha und des Produktes aus isobaren Kompressibilitätsänderung beta und dem partiellen Volumen V0. Bei 298 K erhält man ein G0 von 10,6 ± 0,3 kJ/mol, ein Cp von 12,5 ± 1,2 kJ/mol K, ein S0 von 0,16 ± 0,03 kJ/mol K, ein V 0 von -69,0 ± 10,5 mL/mol, ein alpha von 3,1 ± 1,7 mL/mol K und ein beta von 0,019 ± 0,006 mL/mol bar. Bei den 2D-1H, 15NHSQC- Experimenten an HPr I14A konnte für die Aminosäure Gly 13 zu hohem Druck hin (bei den gemessenen Temperaturen zwischen 278 K bis 318 K) eine Aufspaltung in zwei Signale beobachtet werden. Dies deutet auf einen langsamen Austausch mit einem gefalteten Zwischenzustand hin.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
In the available work two projects were accomplished. On the one hand the structure of the ligand binding domain (LBD) of PPARgamma (Peroxisome proliferatoractivator receptor gamma) was determined by NMR and on the other hand the high pressure NMR equipment, already existing, was developed further and used for the investigation of HPr I14A, a Mutante by HPr (histidine containing protein) of S. ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
In the available work two projects were accomplished. On the one hand the structure of the ligand binding domain (LBD) of PPARgamma (Peroxisome proliferatoractivator receptor gamma) was determined by NMR and on the other hand the high pressure NMR equipment, already existing, was developed further and used for the investigation of HPr I14A, a Mutante by HPr (histidine containing protein) of S. carnosus.
Structures from PPARg LBD were determined to date only by the method of the X-Ray diffraction. In order to receive a structure in native environment, the ligand binding domain of PPARg was examined by NMR in absence and presence of the ligand rosiglitazone. In absence of the ligand the NMR spectra of PPARg are exchangewidened and of so low quality that a NMR structure calculation is not possible. In presence of rosiglitazone the quality of the spectra increases by a decrease of the line width considerably, so that approx. 90% of the expected signals become detectable. For the structural calculations 2352 distance information (won from NOESY spectra), 439 angle information (assistance of the program TALOS) and 225 hydrogen bond information (taken out of the X-Ray structures) were used. An overlay of the ten energy-poorest structures, of 1024 calculated, resulted in a RMSD of 0,179 nm for the backbone and for all atoms a RMSD of 0,249 nm. An improvement of the structure could be achieved assistance of a structural refinement in water, which considers the interaction between protein and solution. This improvement could be proven particularly in the values of the angles for the backbone. In order to improve the NMR structure further, the ISIC algorithm developed in Regensburg was used, with whose assistance information from the X-Ray structure could be used. By application this algorithm a well defined structure could be received. Both the RMSD (0.0189 nm for the backbone) and the the angles (99.5% within the permitted ranges of the Ramachandran Plots) showed a clear improvement. From the literature X-Ray structures of free and bound PPARg LBD show a difference particularly by the position of the C-terminal Helix H12. In the structure of PPARg LBD, which was determined by NMR, this Helix takes a special position: It is between the two positions of the X-Ray structure.
During this work the high pressure apparatus was improved. These concerned among other things the protection for the probes, the autoclaves, the treatment of the quartz high pressure cells and methods to remove air of the equipment. Both the security and the handling of the equipment could be increased by these changes. Apart from the static pressure investigations first experiments were made with a NMR pressure jump apparatus.
For high pressure measurements the Mutante HPr I14A was used. This showed a nearly complete denaturation with a pressure of 200 MPa by 318 K. Additional a cooling denaturation for HPr I14A by 278 K and normal pressure was determined. With 278 K and normal pressure the signal of the reference substance DSS in the spectra, which at higher temperatures is well observable, disappears. This suggests itself that in the thermal equilibrium DSS binds into the cavity produced by the mutation. A similar behaviour could be determined by the pressure row by 278 K at 200 MPa. A sharp DSS signal is also seen here at 200 MPa.
From the experimental data the equilibrium constant K could be determined for the equilibrium between natively folded and denatured protein as a function of pressure and temperature. An adjustment of the experimental data to a two state model permitted the determination of the change of the free enthalpy G0, the entropy S0, the heat capacity Cp, the partial molar volume change V 0, the thermal expansion coefficient alpha and the product of isothermal compressibility change beta and the partial volume the V0. With 298 K one keeps a G0 of 10,6 ± kJ/mol, a Cp of 12,5 ± 1.2 kJ/mol K, a S0 bar to 0.3 of 0,16 ± 0.03 kJ/mol K, a V 0 of -69,0 ± 10.5 mL/mol, alpha of 3,1 ± 1.7 mL/mol K and beta of 0,019 ± 0.006 mL/mol. With the 2D-1H,15N-HSQC experiments at HPr I14A Gly 13 a splitting in two Signals to high pressure was observed (at the measured temperatures between 278 K to 318 K). This points on a slow exchange with a folded intermediate state.
The pressure jump apparatus, which was developed by Arnold [Arn02], could be characterized in this work in the most important points: so it was possible to determine, the increase of pressure (for 55 ms) as well as the repeatability of the pressure flank. First test measurements with the amino acid histidine were accomplished, both 1D- and 2D-meassurements. Measurements of HPr I14A showed a different pressure behaviour for different regions of the protein.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 11:20
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