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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-10566
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.12135
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | Oktober 2009 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Hans Robert (Prof. Dr. Dr.) Kalbitzer |
| Tag der Prüfung: | 9 September 2008 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Dr. Hans Robert Kalbitzer |
| Stichwörter / Keywords: | Coronaviren , Nucleocapsid , Immunoassay , Kawasaki-Krankheit , SARS , , coronavirus , nucleocapsid , immunoassay , kawasaki syndrome , sars |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 12135 |
Zusammenfassung (Deutsch)
In dieser Arbeit ist es erstmals gelungen, ein serologisches Nachweisverfahren zu etablieren, welches in der Lage ist Serumantikörper (IgG, IgM, IgA) gegen alle 5 bekannten humanen Coronaviren (HCoV-229E, -NL63, -OC43, -HKU1 und SARS-CoV) parallel in einem einzigen Ansatz zu detektieren. Es werden nur minimale Mengen an Serum benötigt (15 µl). Ideale Antigene sind HCoV Nukleokapsid Proteine. ...
Zusammenfassung (Deutsch)
In dieser Arbeit ist es erstmals gelungen, ein serologisches Nachweisverfahren zu etablieren, welches in der Lage ist Serumantikörper (IgG, IgM, IgA) gegen alle 5 bekannten humanen Coronaviren (HCoV-229E, -NL63, -OC43, -HKU1 und SARS-CoV) parallel in einem einzigen Ansatz zu detektieren. Es werden nur minimale Mengen an Serum benötigt (15 µl). Ideale Antigene sind HCoV Nukleokapsid Proteine. Diese sind in der Lage, eine äußerst robuste humorale Immunantwort zu induzieren und ergeben eine ausgezeichnete Sensitivität. Die Spezifität konnte durch Erhöhung der ionischen Stärke im Serumverdünnungspuffer gekoppelt mit einer Ureaelution entscheidend optimiert werden. Hierdurch wurden gelegentlich auftretende Kreuzreaktionen innerhalb der Gruppe-II-Viren (OC43 und HKU1) unterdrückt. Die einfache und unkomplizierte Handhabung verbunden mit einer hohen Spezifität und Sensitivität, sowie die geringen Herstellungskosten, machen das neu entwickelte System zur idealen Methode bei der vertieften Diagnostik und zu einem geeigneten System für größere epidemiologische Analysen.
Die Leistungsfähigkeit des Line-Immunoassays wurde auch durch Untersuchungen zur HCoV-Seroprävalenz bestätigt. Es wurde erstmalig gezeigt, dass die erst kürzlich entdeckten HCoVs NL63 (Erstbeschreibung 2004) und HKU1 (2005) signifikant zum allgemeinen Spektrum der HCoV-Infektionen beitragen (Seroprävalenz in gesunder erwachsener Bevölkerung NL63: 62,8-94,6%; HKU1: 11,9-71,7%) und wie die anderen HCoVs, mit Ausnahme von SARS-CoV, weltweit verbreitet sind. Tatsächlich weist NL63 in allen untersuchten Populationen die höchste Seroprävalenz auf und kann als bedeutender Erreger respiratorischer Erkrankungen betrachtet werden.
Immunsuppression wirkt sich negativ auf den Aufbau einer robusten IgG Antikörperantwort gegen die verschiedenen HCoV aus. Dies konnte durch Vergleiche HIV-infizierter Personen mit gesunden Kontrollgruppen aufzeigt werden.
Ferner wurde in der vorliegenden Arbeit der postulierte Zusammenhang zwischen einer NL63-Infektion und der Kawasaki Disease, einer systemischen Vasculitis bei Kindern, erstmalig auf serologischer Basis untersucht. Da kein Hinweis auf erhöhte Prävalenz oder akute Infektion mit diesem Virus bei an Kawasaki Syndrom leidenden Kindern festgestellt werden konnte, ist eine Assoziation unwahrscheinlich.
Durch Testungen von Blutproben chinesischer und kanadischer SARS-Patienten konnte die Entwicklung einer robusten humoralen Immunantwort (IgG, IgM, IgA) nach einer SARS-CoV-Infektion nachgewiesen werden. Zudem wurden in einer europäischen und in 20 chinesischen Proben von Spendern, bei denen niemals eine SARS Erkrankung diagnostiziert wurde, IgG-Antikörper gegen SARS-CoV detektiert. Es ist daher davon auszugehen, dass in der Bevölkerung gelegentlich Kontakt zu SARS oder SARS-ähnlichen Viren besteht, welcher zu Serokonversion und asymptomatisch verlaufenden Infektionen führt.
Bei insgesamt 13 SARS-Patienten mit mildem oder schwerem klinischem Verlauf wurden während der akuten und der rekonvaleszenten Phase die Antikörperprofile aller 5 humanen Coronaviren untersucht. Patienten mit milder Erkrankung weisen eine niedrigere Seroprävalenz bezüglich 229E und HKU1 auf als schwerer Erkrankte. Ein durch SARS-CoV ausgelöster Recall-Effekt, der die Basalspiegel von in der akuten Phase vorhandenen 229E und NL63 (und in geringerem Ausmaße auch OC43) Antikörpern stark ansteigen lässt, ist in allen Patienten mit ungünstigem Verlauf zu beobachten. Die Beobachtungen lassen den Schluss zu, dass es sich hierbei um einen infektionsverstärkenden Mechanismus von nicht-neutralisierenden, kreuzreaktiven anti-229E IgG handeln könnte. Dieser Effekt wurde auch bei anderen viralen Infektionen als antibody-dependent enhancement (ADE) beschrieben. Der Befund ermöglicht erstmals eine diagnostische Prädisposition für einen schwereren klinischen Verlauf und die frühzeitige Einleitung von Gegenmaßnahmen.
Mit Versuchen zur zellvermittelten Immunität wurde gezeigt, dass HCoV Nukleokapsid Proteine geeignete Antigene für die T-Zell-Diagnostik darstellen. Die meisten Spender besitzen restimulierbare, für 229E, NL63 und OC43 spezifische T-Zellen. Dagegen konnten bei Stimulation mit dem HKU1 Antigen nur in zwei von zwölf Spendern T-Zellen nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse bestätigen weitgehend die in dieser Arbeit durchgeführten serologischen Untersuchungen. Durch Stimulation mit HLA-Klasse-I restringierten Peptiden und durch Depletionsexperimente konnte mit Hilfe des ELISPOT-Assays festgestellt werden, dass bei der Erkennung von Epitopen auf dem NL63 Nukleokapsid ausschließlich CD4+ T-Helferzellen beteiligt sind. Spezifische CD8+ zytotoxische T-Zellen konnten nicht detektiert werden. Durch Screening einer 15-AS-Peptidbibliothek, welche von dem NL63 Nukleokapsid abgeleitet wurde, konnten insgesamt 9 verschiedene immunoreaktive Peptide identifiziert werden. Das N Protein ist ein wichtiges Antigen in der zellvermittelten Immunität.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
This PhD thesis describes the establishment and evaluation of a novel serologic screening technique, which is capable of simultaneously recognizing serum antibodies directed against all hitherto known strains of human coronaviruses (HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-OC43, HCoV-HKU1 and SARS-CoV) in a single assay. Only minimal serum volumes of less than 15 µl are required. Nucleocapsid (N) proteins were ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
This PhD thesis describes the establishment and evaluation of a novel serologic screening technique, which is capable of simultaneously recognizing serum antibodies directed against all hitherto known strains of human coronaviruses (HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-OC43, HCoV-HKU1 and SARS-CoV) in a single assay. Only minimal serum volumes of less than 15 µl are required. Nucleocapsid (N) proteins were identified to be appropriate antigens. They induce a highly robust immune response and guarantee outstanding diagnostic sensitivity. Specificity was essentially optimized by enhancing the ionic strength in serum dilution buffer, followed by urea elution of low-affinity bound cross-reactive antibodies. Thus, incidental cross-reactions within group-II-viruses (HCoV-OC43, HCoV-HKU1) were broadly suppressed. While this procedure provides high specificity and excellent sensitivity, assay setup and test strip production are straight-forward and cost-effective. Hence, this newly established HCoV Line-Immunoassay could be utilized for in-depths diagnostics and large-scale epidemiological investigations.
Amongst other things, the power of the Line-Immunoassay was confirmed by HCoV seroprevalence studies. It was shown for the first time, that the only recently discovered human coronaviruses NL63 (2004) and HKU1 (2005) contribute significantly to the overall spectrum of coronaviral infections (NL63-seroprevalence in healthy adults: 62,8-94,6%; HKU1: 11,9-71,7%) and are prevalent worldwide, similar to the other human pathogenic strains, except SARS-CoV. In fact, NL63 was the most abundant HCoV in all surveyed cohorts and therefore can be regarded as important respiratory pathogen.
Immunosuppression leads to impaired humoral responses to infections of human coronaviruses, as shown by comparison of HIV-infected individuals with a control cohort.
Moreover, a hypothetical correlation between an infection with HCoV-NL63 and Kawasaki Disease, which is a systemic vasculitis of early childhood, was examined on a serological basis for the first time. Our data strongly suggest that there is no causal association.
A strong humoral response after SARS-CoV infection was demonstrated by screening of serum samples obtained from Chinese and Canadian SARS-patients. Additionally, anti-SARS-CoV antibodies were detected in one European individual and 20 persons from China. None of the tested blood donors were diagnosed of having acquired SARS. It is therefore possible, that SARS-like viruses are transmitted from animal reservoirs leading to seroconversion, without promptly causing serious disease in humans.
HCoV antibody profiles of SARS patients with mild or severe course of disease were examined during acute and convalescent phases. Patients with mild symptoms showed a decreased 229E and HKU1 seroprevalence compared to severely sick persons. In all patients with adverse outcome, a SARS-CoV initiated antibody-recall was detected. This effect included a boost of anti-229E- and anti-NL63- (and to a lesser extent also anti-OC43-) specific IgG. These observations may justify the conclusion, that there is an infection-enhancing mechanism of non-neutralizing, cross-reacting anti-229E IgG. This effect is known as antibody dependent enhancement (ADE) and has previously been described in association with other viral infections. These findings allow a diagnostic predisposition for a severe course of disease. For the first time, it is therefore possible to take counteractive measures at an early stage of infection.
Investigating cell-mediated immunity, it was clearly shown that HCoV nucleocapsid proteins are suitable antigens for T-cell-diagnostics. Most donors, tested in an INF-γ ELISPOT assay, displayed reactive T-cells specific for 229E, NL63 and OC43. Only two out of twelve donors exhibited HKU1 specific T-cells. These results confirm our serological examinations. By stimulation with MHC-class-I restricted peptides together with depletion-experiments, it was found that CD4+ T-helpercells are involved. Specific CD8+ cytotoxic T-cells were not detected. Furthermore, by screening a 15-aminoacid peptide library, encompassing full-length NL63 N, nine immunoreactive MHC-class-II compatible epitopes were identified. Nucleocapsid proteins are important antigens of cell-mediated immunity during HCoV-infections.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 11:20
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