| License: Publishing license for publications excluding print on demand (17MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-11572
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.12223
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 19 February 2009 |
| Referee: | Richard (Prof. Dr.) Warth |
| Date of exam: | 28 January 2009 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Physiologie > Prof. Dr. Richard Warth |
| Keywords: | Chemotaxis , Real time quantitative PCR , Fibrosarkom , B-Lymphozyt , Defensine , Immunreaktion , Chemokine , Rezeptor , Maus , Mensch , Genregulation , Beta-Defensin , antimikrobielle Peptide , Chemokin-Rezeptor , Reportergen-Analyse , antibakterieller Assay , beta-defensin , antimicrobial peptide , chemokine-receptor , reporter-gene analysis , antibacterial assay |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 12223 |
Abstract (German)
Beta-Defensine sind eine Familie kleiner, kationischer und amphiphiler Peptide mit einem Molekulargewicht von ca. 3-6 kDa. Sie werden hauptsächlich von Epithelzellen exprimiert und weisen antimikrobielle Aktivität gegen Bakterien, Viren und Pilze auf. Zudem aktivieren sie die Immunantwort, indem sie mittels CC-Chemokinrezeptor CCR6-abhängiger Chemotaxis Leukozyten rekrutieren. Die ...
Abstract (German)
Beta-Defensine sind eine Familie kleiner, kationischer und amphiphiler Peptide mit einem Molekulargewicht von ca. 3-6 kDa. Sie werden hauptsächlich von Epithelzellen exprimiert und weisen antimikrobielle Aktivität gegen Bakterien, Viren und Pilze auf. Zudem aktivieren sie die Immunantwort, indem sie mittels CC-Chemokinrezeptor CCR6-abhängiger Chemotaxis Leukozyten rekrutieren. Die Beta-Defensinfamilie der Maus umfasst eine große Zahl an bisher meist nur auf genomischer Ebene identifizierter Gene. Erst wenige dieser Beta-Defensine wurden bisher synthetisiert oder rekombinant exprimiert und bezüglich ihrer biologischen Funktion untersucht. Im Rahmen dieser Arbeit konnte nun erstmals das neue Beta-Defensin 14 der Maus (mBD14) als Ortholog des humanen Beta-Defensin 3 (hBD3) beschrieben werden.
Entsprechend der Expression von hBD3 wurde die mRNA-Expression von mBD14 erstmals in verschiedenen Organen der Maus, darunter Trachaea, Lunge, Magen und Darm sowie in BMDCs nachgewiesen. Diese Expression wird durch die Stimulierung verschiedener Pattern-recognition-Rezeptoren wie z. B. Toll-like-Rezeptoren reguliert. Als weiterer intrazellulärer Pattern-recognition-Rezeptor wurde NOD2/CARD15 untersucht. Reportergen-Analysen zeigten, dass NOD2/CARD15-Aktivierung nach Stimulierung mit dessen Ligand MDP, einem Bestandteil des Peptidoglykans bakterieller Zellwände, zur Induktion der mBD14-Expression führt.
Das für weitere funktionelle Untersuchungen hergestellte mBD14:Ig-Fusionsprotein zeigte in antimikrobiellen Assays die für die Beta-Defensin-Familie charakteristische antimikrobielle Aktivität gegen Gram-positive und Gram-negative Bakterien.
Überdies wurde der Chemokinrezeptor CCR6 der Maus als potenzieller Rezeptor für mBD14 in HEK-293 Zellen exprimiert und anschließend die Bindung von mBD14:Ig an mCCR6 mittels durchflusszytometrischer Analysen nachgewiesen. In Chemotaxisversuchen mit hCCR6- oder mCCR6-exprimierenden HEK-293 Zellen sowie humanen PBMCs und residenten Peritonealzellen der Maus wurde eine speziesspezifische Interaktion von mBD14 und von mBD4 mit mCCR6 festgestellt. Im Gegensatz dazu zeigte sich, dass hBD2 und hBD3 sowohl mit mCCR6 als auch mit hCCR6 interagieren können. Zudem wurde die Bindung von mBD14:Ig an B-Lymphozyten, die endogen CCR6 exprimieren, nachgewiesen. Außerdem wurde gezeigt, dass auf Monozyten, die keinen funktionellen CCR6-Rezeptor exprimieren, noch ein weiterer chemotaktischer Rezeptor für Beta-Defensine exprimiert werden muss.
Im BFS-1-Fibrosarkom-Tumormodell konnte nachgewiesen werden, dass die intratumorale mBD14:Ig-Expression das Tumorwachstum fördert, ohne jedoch das Wachstumsverhalten der BFS-1-Fibrosarkomzellen in vitro zu verändern. In Korrelation zu den Versuchen zur Interaktion von mBD14:Ig mit mCCR6 konnte gezeigt werden, dass der prozentuale Anteil an CCR6+ B220+ B-Lymphozyten in mBD14:Ig exprimierenden Tumoren, gemessen an der Gesamtheit tumorinfiltrierender Zellen, signifikant erhöht war. Anhand immunhistochemischer Untersuchungen wurde in mBD14:Ig-exprimierenden Tumoren ein erhöhter Anteil vaskulärer Gefäßstrukturen nachgewiesen, die eine Voraussetzung für das beobachtete verbesserte Tumorwachstum darstellen.
Schließlich konnte mBD14 als neues Mitglied der Beta-Defensinfamilie identifiziert und charakterisiert werden. In weiteren Experimenten zeigte sich, dass mBD14 nicht nur als antimikrobielles Peptid im Rahmen der angeborenen Immunabwehr eine wichtige Rolle spielt, sondern, dass mBD14 ebenso Einfluss nimmt auf antigenpräsentierende Zellen sowie auf Lymphozyten des adaptiven Immunsystems und somit immunmodulatorisch wirken kann.
Translation of the abstract (English)
Beta-defensins form a family of small, cationic and amphiphilic polypeptides with a molecular weight of 3-6 kDa, which is mainly expressed by epithelial cells. They have antimicrobial activity against bacteria, some enveloped viruses and fungi. In addition, they activate the immune response by inducing CC-chemokine receptor 6 (CCR6)- dependent chemotaxis of leukocyte subpopulations. The mouse ...
Translation of the abstract (English)
Beta-defensins form a family of small, cationic and amphiphilic polypeptides with a molecular weight of 3-6 kDa, which is mainly expressed by epithelial cells. They have antimicrobial activity against bacteria, some enveloped viruses and fungi. In addition, they activate the immune response by inducing CC-chemokine receptor 6 (CCR6)- dependent chemotaxis of leukocyte subpopulations. The mouse beta-defensin family covers a high number of genes that have been identified mostly by genome sequencing so far. Only few beta-defensins have been synthesized or expressed recombinantly and analyzed concerning their biological functions. Within this work it was shown for the first time that mBD14 is the mouse orthologue of hBD3. According to the expression pattern of hBD3 the expression of mBD14-mRNA was detected for the first time in different mouse tissues, e.g. trachaea, lung, stomach and intestine as well as BMDCs. Stimulation of different pattern-recognition receptors, e.g. toll-like receptors, regulates the mBD14 expression. Reporter gene analysis showed that mBD14 expression is induced in response to activation of NOD2/CARD15, another pattern-recognition receptor, after stimulation with muramyldipeptide, a component of bacterial cell walls. For further functional analysis an mBD14:Ig fusion protein was produced. This mBD14 fusion protein demonstrated the antimicrobial activity against gram-positive and gram-negative bacteria, typical for beta-defensins.
Moreover, the mouse chemokine receptor CCR6, which is a prospective receptor for mBD14, was expressed in HEK-293 cells. Afterwards, the binding of mBD14:Ig to mCCR6 was shown using flow cytometry. Chemotaxis assays with hCCR6- or mCCR6-expressing HEK-293 cells, human PBMCs, and mouse resident peritoneal cells revealed a species-specific interaction of mBD14 and mBD4 with mCCR6. By contrast, it was shown that hBD2 and hBD3 are able to interact with hCCR6 as well as mCCR6. In addition, binding of mBD14:Ig to B-lymphocytes that produce CCR6 endogenously was detected. Furthermore, it was shown that in monocytes, which do not produce a functional CCR6 receptor, another chemotaxis inducing receptor must be expressed.
Using the BFS-1 fibrosarcoma tumor model it was demonstrated that intratumoral expression of mBD14:Ig promotes tumor growth without altering growth behavior of BFS-1 fibrosarcoma cells in vitro. In correlation to the interaction of mBD14:Ig with mCCR6 it was shown that the percentage of CCR6+ B220+ B-lymphocytes of the tumor infiltrating cells was significantly increased in mBD14:Ig expressing tumors. On the basis of immunhistochemical analysis, increased vascularization, which is required for the observed promotion of tumor growth, was found in mBD14:Ig expressing tumors.
Finally, mBD14 was identified and characterized as a new member of the mouse beta-defensin family. It was shown that mBD14 with its antimicrobial capacity plays an important role in innate immunity. But it also acts on antigen presenting cells and lymphocytes of the adaptive immune system and therefore functions as an immunmodulator.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 11:13
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