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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-11799
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.12236
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 15 March 2009 |
| Referee: | Birgit (Prof. Dr.) Lorenz |
| Date of exam: | 16 February 2009 |
| Institutions: | Medicine > Abteilung für Pädiatrische Ophthalmologie, Strabismologie und Ophthalmogenetik |
| Keywords: | Chorioideremie , Heterozygotie , REP-1 Gen , Lyonisierung , chorioideremie , rep-1 gene , lyonisation |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 12236 |
Abstract (German)
Chorioideremie (CHM) ist eine X-chromosomal rezessiv vererbte Augenkrankheit. Charakteristisch für die Krankheit ist die progressive Degeneration der Photorezeptoren, des retinalen Pigmentepithels (RPE) und der Choriokapillaren (CHC) als Folge von Mutationen im REP-1 Gen. Hemizygote Männer klagen in der ersten oder zweiten Lebensdekade über Nachtblindheit, gefolgt von progredienten ...
Abstract (German)
Chorioideremie (CHM) ist eine X-chromosomal rezessiv vererbte Augenkrankheit. Charakteristisch für die Krankheit ist die progressive Degeneration der Photorezeptoren, des retinalen Pigmentepithels (RPE) und der Choriokapillaren (CHC) als Folge von Mutationen im REP-1 Gen. Hemizygote Männer klagen in der ersten oder zweiten Lebensdekade über Nachtblindheit, gefolgt von progredienten Gesichtsfeldausfällen, verminderter Sehschärfe und geringer Myopie. In höherem Alter zeigt die Mehrheit der untersuchten Patienten mit CHM ein gutes zentrales Sehvermögen. Im Endstadium kommt es zu einer zunehmenden Verminderung der Sehschärfe und des zentralen Sehvermögens.
Frauen als Konduktorinnen (heterozygot) zeichnen sich durch ein meist asymptomatisches Krankheitsbild aus. Sie weisen jedoch deutliche Veränderungen in Form einer mottenfraß-ähnlichen, gefleckten Pigmentveränderung in der Peripherie des Fundus auf. Die feingranuläre Hyperpigmentierung und manchmal Atrophie des RPE deuten auf einen Gendefekt eines X-chromosomalen REP-1 Gens hin. Das mosaikartige Muster der Netzhautpigmentierung kann auf die zufallsbedingte Inaktivierung des X-Chromosoms zurückgeführt werden (=Lyonisierung). Eine Funktionsstörung, bedingt durch eine vorwiegende Aktivität des mutierten Allels, führt zur stärkeren Ausprägung von CHM. Bei einigen Frauen kann dies im höheren Alter zu Nachtblindheit, Photophobie oder gelegentlich zur Einschränkung des Sehfeldes führen.
Das zu untersuchende Patientengut bestand aus 5 Trägerinnen bekannter Sequenzveränderung auf dem REP-1 Gen. Drei Konduktorinnen zeigten pathogene Sequenzveränderungen, die zu einem vorzeitigen Translationsstop führen (Deletion, Insertion, Nonsensemutation). Zwei Probandinnen zeigen einen Polymorphismus in Form einer funktionsstabilen Missensemutation.
Mit einer molekulargenetischen Untersuchungsreihe des REP-1 Gens sollte die Verteilungshäufigkeit ermittelt werden, inwiefern eine Trägerin für Sequenzveränderungen des REP-1 Gens den Wildtyp oder ein sequenzverändertes Allel in Lymphoblastoidzellinien exprimiert. Dazu wurden von Konduktorinnen mit bekannten pathogenen REP-1-Mutation und Probandinnen mit benignen Missense-Mutationen Einzelzellen aus EBV-transformierten Lymphoblastoidzelllinien isoliert und deren RNA über die RT-PCR auf die Expression des veränderten Allels untersucht.
Die Fragmentanalyse mit dem ABI PRISM SNaPshot Multiplex Kit ermöglichte die Untersuchung des exprimierten Alleles auf qualitative und quantitative Weise. Dabei wurde ein zur Zielsequenz komplementärer Primer um ein einziges ddNTP verlängert, welches komplementär zum SNP war. Die fluoreszent markierten Primer wurden kapillarelektrophoretisch der Größe nach aufgetrennt. So konnte die die Expression der Allele untersucht werden. Durch eine Verdünnungsreihe von Kontrolltemplates konnte nachgewiesen werden, dass die eingesetzte Methodik (sowohl die PCR, als auch die Kapillarelektrophorese) quantitativ arbeitet. Für die eigentliche Untersuchung wurden je Zellkultur 10 Zellen gewonnen. Für Probandin 38.2 wurde in den 10 untersuchten Zellen zu 100 % die Mutation exprimiert. Diese Zellen wiesen eine Restaktivität des inaktivierten X-Chromosoms von ca. 1,1 % auf. Bei Probandin 38.4 wurde auch zu 100 % die Mutation exprimiert. Zu ca. 4 % konnte eine Restaktivität für den Wildtyp nachgewiesen werden.
Konduktorin 673.1 exprimierte in den untersuchten Zellen zu 90 % den Wildtyp mit einer Restaktivität von 4 % für die Mutation. In den restlichen 10 % der Proben in denen die Mutation exprimiert wurde, konnte keine Restaktivität für den Wildtyp nachgewiesen werden.
Bei Konduktorin 716.1 kam es zu einer gleichmäßigen Verteilung der Allele mit Mutation und Wildtyp. Die Zellen in denen der Wildtyp exprimiert wurde, hatte das inaktivierte X-Chromosom mit der Mutation eine Restaktivität von 20 %. Die andere Hälfte der Proben, in denen vorwiegend die Mutation exprimiert wurde, wies im Durchschnitt eine Restaktivität von 34 % für den Wildtyp auf. Bei diesen 10 Zellen griff die Lyonisierung nicht, sondern es kam zu einem erhöhten Maß an Restaktivität. Durch ein vorzeitiges Stopcodon in Exon 6 bei Konduktorin 617.3, konnte durch den NMD (= nonsense mediated decay) kein PCR-Produkt hergestellt werden.
Als Fazit konnte die These von Carrel et al. bestätigt werden, dass humane X-gebundene Gene (hier REP-1 Gen) der X-Inaktivierung entkommen können und daher sowohl vom aktiven als auch vom inaktivierten X-Chromosom exprimiert werden. In unserer Untersuchung konnte dies einerseits für Polymorphismen als auch für zwei pathologische Sequenzveränderungen (Deletion bzw. Insertion) gezeigt werden.
Translation of the abstract (English)
Chorioideremie (CHM) is an X-linked recessive eye-disease. Characteristic for this disease is the progressive degeneration of the photoreceptors, the retinal pigment epithelum (RPE), and the choriocapillaries (CHC) as a result of mutations in the REP-1 gene. Hemizygote men complain about night blindness in the first or second decade, followed by progressive loss of the visual field, reduced ...
Translation of the abstract (English)
Chorioideremie (CHM) is an X-linked recessive eye-disease. Characteristic for this disease is the progressive degeneration of the photoreceptors, the retinal pigment epithelum (RPE), and the choriocapillaries (CHC) as a result of mutations in the REP-1 gene. Hemizygote men complain about night blindness in the first or second decade, followed by progressive loss of the visual field, reduced visual acuity and low myopia. In older age the majority of the examined patients with CHM show a good central vision. In the final stage visual acuity and central vision are reduced.
Women as heterozygous carriers are mostly asymptomatic. They exhibit mottling of the pigment in the periphery of the fundus. The subtle granulare hyperpigmentation and sometimes the atrophy of the RPE are suggestive of a mutation in the REP-1 gene. The mosaic pattern of the retinal pigmentation can be attributed to a randomed inactivation of X-linked genes (= lyonisation). A dysfunction by predominat activity of the mutated allele results in a more severe disease. This can lead to night blindness, photophobie and sometimes to a reduced visual field for women in higher age.
The patients examined in this study consisted of five probands with known mutations in the REP-1 gene. Three carriers showed pathogenic mutations, which lead to a premature translation-stop (deletion, insertion, nonsense-mutation). Two probands showed a polymorphism in the form of a functional missense mutation.
With a molecular genetic examination on the REP-1 gene we determined the extent a carrier expressed the mutant and the wild type allele of the REP-1 gene in a single lymphoblastoid cell. For that purpose we isolated single cells out of EBV-transformed lymphoblastoid cell linies from carriers with known pathogenic REP-1 mutations and from probands with a benign missense mutation and examined the expression of this allele by RT-PCR.
The following fragment-analysis using the ABI PRISM SNaPshot Multiplex Kit examined the expression of the allele in quality and quantity. Herefore, a complementary primer to the sequence in question was extented by a single ddNTP, which was complementary to the SNP (single nucleotide polymorphism) in question. The primer fluorescently labelled by the single nucleotide extension was separated in size by capillary eletrophoresis. As result the expression of the allele could be examined. With a dilution series of control-template combinations we verified that the method (PCR and capillary electrophoresis) provides quantitative results.
For the examination we isolated 10 solitary cells from each culture.
Proband 38.2 expressed 100 % mutation in 10 solitary cells. The cells showed residual activity of the inactivated chromosom with 1,1 %. Also proband 38.4 expressed 100 % mutation with 4 % residual activity for the wildtyp.
Conductor 673.1 expressed in 90 % of the cases the wildtyp-allele with 4 % residual activity for the mutation. The other 10 % of the samples with the mutation had no residual activity for the wildtyp.
Carrier 716.1 had an equal distribution of the mutant and the wildtyp-allele. The cells with expression of the wildtyp-allele the residual activity of the inactivated chromosom with mutation was 20 %. The other part of the probes with expression of the mutation exhibited on average at least 34 % residual activity for the wildtyp. For that 10 cells the lyonisation was not complete, instead the residual activity was increased.
Because of a premature stopcodon in exon 6 on the REP-1 gene in carrier 617.3, which causes NMD (= nonsense mediated decay), no template could be produced.
As result the thesis of Carrel et al. could be confirmed, that human X-linked genes (here REP-1 gene) can escape the X-inactivation and they will be expressed by the active and also by the inactivated X-chromosom. This was shown for the polymorphisms and on the other hand for two pathologic mutations ( deletion and insertion) in this study.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 11:12
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