Bisher galt die Kultivierung von multizellulären Sphäroiden (MCTS) im �Liquid-Overlay�-Verfahren als sehr zeit- und arbeitsintensiv. MCTS waren daher nur bedingt für einen Einsatz bei der routinemäßigen Wirkstofftestung geeignet. In der vorgelegten Arbeit konnte das dreidimensionale MCTS-Modell durch Optimierung, Standardisierung und Adaption von Kulturbedingungen und Analytik an industrielle ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Bisher galt die Kultivierung von multizellulären Sphäroiden (MCTS) im �Liquid-Overlay�-Verfahren als sehr zeit- und arbeitsintensiv. MCTS waren daher nur bedingt für einen Einsatz bei der routinemäßigen Wirkstofftestung geeignet. In der vorgelegten Arbeit konnte das dreidimensionale MCTS-Modell durch Optimierung, Standardisierung und Adaption von Kulturbedingungen und Analytik an industrielle Anforderungen beim Wirkstoff-Screening angepasst werden. So konnte mit Hilfe eines automatisierten Pipettiersystems die Aussaat und die Behandlung mit Wirkstoffen sowohl von Sphäroiden als auch von Monolayerkulturen im 96-Well Format teilautomatisiert werden. Zusätzlich wurden erstmals adäquate und reproduzierbare Ergebnisse bei der Sphäroidbildung auf einem kommerziell erhältlichen Plattensystem gezeigt. Zudem wurde die Bildaufnahme von Sphäroiden einer 96-Well Mikrotiterplatte vollständig automatisiert, wodurch es nun problemlos möglich ist, den Sphäroiddurchmesser im High-Throughput-Screening (HTS) über einen längeren Zeitraum hinweg zu bestimmen. Bildverarbeitenden Algorithmen erlauben eine (semi)automatisierte Analyse des Sphäroid-Wachstums bzw. einer Wachstumsverzögerung nach einer Behandlung mit wachstumsfördernden bzw. -hemmenden Faktoren und Wirkstoffen. Weiterhin wurde gezeigt, dass nach einer Modifikation des Standardprotokolls der ursprünglich für Monolayerkulturen entwickelte Acid Phosphatase (APH) Assay zur Bestimmung der Zytotoxizität/Vitalität an sieben Kolonkarzinomzell-Sphäroiden (DLD-1, HCT-116, HCT-15, HT29, KM12L4A, KM20L2 und WiDr) einfach und schnell durchführbar ist. Eine Dissoziation der Sphäroide ist dabei nicht notwendig, das APH Signal ist abhängig von der Zelllinie bis zu einem maximalen Sphäroiddurchmesser von 530-900 µm linear und hoch sensitiv. Mit Hilfe des APH Assays war es möglich, die Effekte zehn bereits bekannter Wirkstoffe (Doxorubicin, Paclitaxel, Carboplatin, Cisplatin, 5-FU, Mitoxantron, CCNU/Lomustine, Irinotecan und Epidoxorubicin) und zweier neuer Anti-Tumor-Wirkstoffkandidaten (C-1311 und WMC-79) auf HT29 und HCT-116 Monolayer- und Sphäroid-Kulturen zu untersuchen. Die Standardisierung und (Teil-)Automatisierung der Sphäroidkultivierung und -analytik, und die Validierung des APH Assays zur schnellen und reproduzierbaren Ermittlung der Zellvitalität in Sphäroid-Kulturen erfüllen wichtige Voraussetzungen für einen (semi)automatisierten Einsatz des MCTS Modells beim Wirkstoff-Screening. Diese Aspekte können wesentlich dazu beitragen, die Lücke zwischen Monolayerkulturen und Tiermodellen im Prozess der Anti-Tumor-Wirkstoff-Entwicklung und -Testung zu schließen.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Up to now culturing of multicellular spheroids (MCTS) in �liquid overlay� was valid as time consuming and labor-intensive. Hence, this 3-D test system has not yet been incorporated into mainstream drug development operations. The objective of this work was to adapt the MCTS model for routine anti-tumor drug screening due to optimization, standardization and adaption of spheroid culturing and ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Up to now culturing of multicellular spheroids (MCTS) in �liquid overlay� was valid as time consuming and labor-intensive. Hence, this 3-D test system has not yet been incorporated into mainstream drug development operations. The objective of this work was to adapt the MCTS model for routine anti-tumor drug screening due to optimization, standardization and adaption of spheroid culturing and analysis. Seeding and drug treatment of spheroids as well as monolayer cultures in a 96-well approach was (semi)automated using an automated multichannel pipetting system. In addition, a reproducible formation of single spheroids per well in current commercially available non-adherent 96-well plates was detected for the first time. Furthermore, image acquisition of spheroids cultured in 96-well microplates was automated, whereby long-run estimation of spheroid diameters for High-Throughput-Screening (HTS) purposes is guaranteed. Spheroid analysis was performed semiautomatically through implemented, image-processing algorithms in the AxioVision 4.5 Software (Zeiss), which allows reliable and reproducible area selection to determine spheroid diameter and volume. Moreover, the Acid Phosphatase (APH) assay frequently used for monolayer cultures for determining drug-induced cytotoxic/cytostatic effects showed convincing sensitivity using a standardized protocol for rapid routine analysis of single spheroids. The APH assay is 1) applicable for single spheroids of seven colon carcinoma cell lines (DLD-1, HCT-116, HCT-15, HT29, KM12L4a, KM20L2, and WiDr) in 96-well plates, 2) does not require spheroid dissociation, 3) is linear and highly sensitive for spheroids up to a size of 530-900 µm depending on cell line. The APH assay was then applied in HT29 and HCT-116 monolayer cultures and spheroids, respectively, to quantify and compare drug sensitivity of ten well-known compounds (Doxorubicin, Paclitaxel, Carboplatin, Cisplatin, 5-FU, Mitoxantron, CCNU/Lomustine, Irinotecan, and Epidoxorubicin) and two potential antitumor drug candidates (C-1311 and WMC-79). Standardization and (semi)automation of spheroid culturing and analysis, as well as the validation of the APH assay for rapid and reproducible determination of cell viability in spheroid cultures is a prerequisite for the automated application of the MCTS model system for drug screening purposes and will essentially help to fill the gap between monolayer cultures and animal models in the process of antitumor drug development and testing.
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