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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-12833
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.12299
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 15 Juni 2009 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Alfons Penzkofer |
| Tag der Prüfung: | 20 März 2009 |
| Institutionen: | Physik > Institut für Experimentelle und Angewandte Physik > Entpflichtete oder im Ruhestand befindliche Professoren > Arbeitsgruppe Alfons Penzkofer |
| Stichwörter / Keywords: | UV-VIS-Spektroskopie , Fluoreszenz , Photorezeptor , Quantenausbeute , Proteine , Flavoenzym , BLUF-Protein-Domänen , Flavoproteine , Photozyklus , Fluoreszenzlebensdauer , Photodegradation , Electron transfer , BLUF domain proteins , flavo-protein , photocycle , fluorescence lifetime , photodegradation |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 530 Physik |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 12299 |
Zusammenfassung (Englisch)
Light is one of the most important environmental signals for the living organisms on earth. Light in the blue region of spectrum has been linked to the evolution of photosynthesis. Living organisms detect and respond to blue light by either photoprotection systems or maximally exploiting this signal by entraining their circadian rhythms or optimizing their photosynthetic efficiency. This ...
Zusammenfassung (Englisch)
Light is one of the most important environmental signals for the living organisms on earth. Light in the blue region of spectrum has been linked to the evolution of photosynthesis. Living organisms detect and respond to blue light by either photoprotection systems or maximally exploiting this signal by entraining their circadian rhythms or optimizing their photosynthetic efficiency. This detection is done with the help of blue light photoreceptors They have a polypeptide domain with light absorbing cofactor (chromophore). Four families of blue light photoreceptors have been discovered so far. They are the xanthopsins using p-coumaric acid as chromophore and three flavin cofactor based classes. These flavin based families are the cryptochrome (cofactor is FAD= flavin adenine dinucleotide, one action is the circadian rhythm), the phototropins (have LOV domain with FMN= flavin-mononucleotide as cofactor, cause plant orientation towards light), and the BLUF proteins (BLUF = blue light sensor using FAD) with BLUF domain (may cause phototaxis besides others).
Proteins with BLUF domains are the latest family of blue light photoreceptors discovered. BLUF domains have been found in many multi-domain proteins like AppA from the phototrophic proteobacterium Rhodobacter sphaeroides, YcgF from Escherichia coli, PAC (photoactive adenylyl cyclase) from the unicellular flagellate Euglena gracilis, BlrP in Escherichia coli, and BlrP from the enteric bacterium Klebsiella pneumoniae. They have been also found in single domain proteins like BlrB from Rhodobacter sphaeroides, Slr1694 from cyanobacterium Synechocystis sp.PCC6803, and Tll0078 of the thermophilic unicellular cyanobacterium Thermosynechococcus elongates BP-1.
In this work, the photodynamics of the BLUF domain BlrP1_BLUF and of the full-length protein BlrP1 from K. pneumoniae has been studied by absorption and fluorescence spectroscopy under dark-adapted, light-adapted and prolonged light exposure conditions. The full-length protein consists of a BLUF domain and an EAL domain. BlrP_BLUF contains no tryptophan. The cofactor FAD in the dark-adapted state (receptor state) is present in its oxidized state (FADox). Light excitation causes electron transfer from an adjacent tyrosin to FADox changing it to the anionic semiquinone state (FAD.-). During the lifetime of the FAD.-�Tyr+ charge-transfer complex (ca. 100 ps) a rearrangement of the hydrogen-bonding structure around the FAD binding pocket occurs which forms the signaling state (FADox in different hydrogen-bonding surroundings). The signaling state relaxes back to the initial receptor state in the dark (on a minute time scale).
The full-length protein BlrP1 and the domain BlrP1_BLUF show a similar absorption and emission behavior. Upon blue light absorption, the BLUF domain changes from the receptor state to the signaling state with a 10 nm red-shifted first absorption band. The quantum yield of signaling state formation was found to be 16% for BlrP1_BLUF and 8% for BlrP1. The recovery of the signaling state back to the receptor state (dark state) in the dark is temperature dependent. At 20 °C the recovery times are 51.2 s for BlrP1_BLUF and 89.3 s for BlrP1. The recovery time is determined by a potential energy barrier between the signaling state and the receptor state. The fluorescence quantum yield of the FADox is small (about 0.0014 in the receptor state and 0.0005 in the signaling state of BlrP1_BLUF, the corresponding values for BlrP1 are about 0.002 and 0.0012) because of photo-induced reductive electron transfer. Fluorescence lifetime measurements have yielded a tri-exponential fluorescence decay with lifetimes in the sub-ps region, the 5-10 ps region and the 100 ps region. The two fast fluorescence decays are due to photo-induced intermolecular charge-transfer (reductive electron transfer from an adjacent electron donating tyrosine to the electron accepting photo-excited FADox whereby anionic FAD-semiquinone, FAD.- is formed). The slower fluorescence component is caused by time-delayed emission of FADox due to equilibration between the locally excited FADox and the FAD.-�Tyr+ charge-transfer complex. The slow fluorescence component lifetime is determined by the charge recombination of FAD.-�Tyr+ to FADox and Tyr.
Prolonged photo-excitation of BlrP1_BLUF and BlrP1 in the light-adapted signaling state causes transfer of FADox to fully reduced anionic FAD hydroquinone (FADredH-) and some release of FAD from the protein with subsequent photo-degradation. After light switch-off a partial re-oxidation of FADredH- to FADox was observed for BlrP1_BLUF, while no re-oxidation occurred in BlrP1.
For BlrP1_BLUF and BlrP1 a receptor state � signaling state photocycle scheme and for the signaling state a photo-induced electron-transfer scheme and photo-reduction were developed.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Licht ist einer der wichtigsten Regulatoren and Aktivatoren für lebende Organismen. Es ist die Energiequelle für die Photosynthese. Licht-aktive Domänen in Proteinen lebender Organismen absorbieren Light und bewirken verschiedene Reaktionen wie Phototropismus bei Pflanzen, zirkadischen Rhythmus bei Menschen und Tieren oder Phototaxis bei Flagellaten. Auf Licht reagierende Proteine heißen ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Licht ist einer der wichtigsten Regulatoren and Aktivatoren für lebende Organismen. Es ist die Energiequelle für die Photosynthese. Licht-aktive Domänen in Proteinen lebender Organismen absorbieren Light und bewirken verschiedene Reaktionen wie Phototropismus bei Pflanzen, zirkadischen Rhythmus bei Menschen und Tieren oder Phototaxis bei Flagellaten. Auf Licht reagierende Proteine heißen Photorezeptoren. Sie haben eine Polypeptiddomäne mit Licht absorbierendem Kofaktor. Im blauen Spektralbereich hat man bisher vier Familien von Blaulichtphotorezetoren gefunden. Dabei handelt es sich um Xanthopsin mit p-Kumarsäure als Kofakor und um drei Flavin Kofaktor basierte Gruppen, die Cryptochrome (Kofaktor ist FAD= Flavin-Adenin-Dinukleotid, eine Wirkung ist der zirkadische Rhythmus), die Phototropine (haben LOV-Domäne mit FMN= Flavin-Mononukleotid als Kofaktor und bewirken die Pflanzenausrichtung zum Licht hin), und die BLUF-Proteine (BLUF = blue light sensor using FAD) mit BLUF-Domäne (bewirken neben anderem Phototaxis).
Die Proteine mit BLUF-Domänen sind die bisher als letzte entdeckte Familie der Blaulichtphotorezeptoren. Sie wurden in vielen Mehrdomänenproteinen gefunden wie zum Beispiel in AppA des phototropen Proteobakteriums Rhodobakter sphäroides, in YcgF von Escherichia coli, in PAC (photoactive adenylyl cyclase) des uni-zellulären Flagellaten Euglena gracilis, in BlrP (blue-light regulated phosphodiasterase) des Darmbakteriums Klebsiella pneumoniae sowie in den Eindomänenproteinen (BLUF-Domäne = BLUF-Protein) BlrB von R. sphäroides, Slr1694 des Cyanobakteriums Synchocystis sp. PCC6803 und Tll0078 des thermophilen uni-zellulären Cyanobakteriums Thermosynechococcus elongates BP-1.
In der vorliegenden Dissertation wurde die Photodynamik der separaten BLUF-Domäne BlrP1_BLUF und des Gesamtproteins BlrP1 von K. pneumoniae studiert mittels Absorption- und Fluoreszenzspektroskopie im dunkel adaptierten Zustand, im licht adaptierten Zustand, und bei langer intensiver Lichtanregung. Das Gesamtprotein besteht aus einer BLUF-Domäne und einer EAL Domäne. Der Kofaktor FAD im Dunkeladaptieren Zustand (Rezeptorzustand) ist im oxidierten Redoxzustand (FADox). Bei Lichtanregung erfolgt durch photo-induzierten Elektronentransfer von einem angrenzenden Tyrosin eine Wandlung in den anionischen Semiquinonzustand (FAD.-). Während der Lebensdauer des FAD.- -Tyr+ Ladungstransferkomplexes (ca. 100 ps) erfolgt eine Wasserstoffbrücken-Umbildung in der FAD Bindungstasche und damit die Formung des Signalzustandes (FADox mit geänderter Waserstoffbrückenbindungsstruktur). Der Signalzustand relaxiert im Dunkeln zurück in den Ausgangsrezeptorzustand (im Minutenbereich).
Das Ganzlängenprotein BlrP1 und die Domäne BlrP1_BLUF zeigten ein ähnliches Absorptions- und Emissionsverhalten. Infolge von Blaulichtanregung wandelte sich die BLUF Domäne vom Rezeptorzustand in den Signalzustand mit 10 nm rot verschobenen ersten Absorptionsband. Die Quanteneffizienz der Signalzustandsbildung was 16 % bei BlrP1_BLUF und 8 % bei BlrP1. Die Rückwandlung vom Signalzustand in den Rezeptorzustand im Dunkeln war temperaturabhängig. Bei 20 °C waren die Rückwandlungszeiten 51,2 s bei BlrP1_BLUF und 89,3 s bei BlrP1. Die Rückwandlungszeit wird durch eine Aktivierungspotentialbarriere zwischen dem Signalzustand und dem Rezeptorzustand bestimmt. Die Fluoreszenzquantenausbeute des FADox Kofaktors was klein (rund 0,0014 im Rezeptorzustand und rund 0,0005 im Signalzustand bei BlrP1_BLUF; entsprechend 0,002 und 0,0012 bei BlrP1) infolge von photo-induziertem reduktiven Elektronentransfer.Fluoreszenzlebensdauermessungen ergaben ein tri-exponentielles Fluoreszenzabklingen mit Lebensdauern im Sub-ps bereich, 5 bis 10 ps Bereich, und 100 ps Bereich. Die beiden kurzen Fluoreszenzlebensdauern wurden durch reduktiver Elektronentransfer von einem angrenzenden Tyrosin Elektronendonator zum angeregten FADox Elektronenakzeptor wobei anionisches FAD-Semiquinon FAD.- entsteht. Die langsamere Fluoreszenzkomponente kommt aus Zeitverzögerter Emission von FADox infolge einer Gleichgewichtseinstellung zwischen lokal angeregtem FADox und dem FAD.- -Tyr+ Ladungstransferzustand. Ihre Zeitdauer ist durch Ladungsrekombination von FAD.- -Tyr+ zu FADox und Tyr begrenzt.
Langzeit Lichtanregung im blauen Spektralbereich wandelte FADox im Signalzustand zu voll reduziertem anionischen FAD-Hydroquinon (FADredH-) und verursachte eine geringe FAD Herauslösung aus dem Protein mit nachfolgender FAD-Photodegradation. Bei BlrP1_BLUF wurde nach Lichtabschaltung eine teilweise Re-Oxidierung von FADredH- zu FADox beobachtet, während beim BlrP1 die Reduzierung irreversibel war.
Für BlrP1_BLUF und BlrP1 wurde ein Rezeptor-Signal Photozyklusschema und für den Signalzustand ein photoinduziertes Elektronentransferschema und Photoreduktionsschema erarbeitet.
Metadaten zuletzt geändert: 25 Nov 2020 15:10
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