Beiträge zur Mikrochip-Elektrophorese

Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Open Access Type:	Primary Publication
Date:	6 August 2009
Referee:	Detlev (Prof. Dr.) Belder
Date of exam:	26 June 2009
Institutions:	Chemistry and Pharmacy > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik
Keywords:	Mikrochip-Elektrophorese , Laserinduzierte Fluoreszenz , Funktionskunststoff , Organische Beschichtung , Mikrofluidik , Funktionelle Polymere , intrinsische / native Fluoreszenzdetektion , hydrophile Oberflächen , zweiphotonenangeregte Fluoreszenz , Chipherstellung , Proteine , intrinsic / native fluorescence detection , hydrophilic surfaces , two-photon excited fluorescence , chip production , proteins
Dewey Decimal Classification:	500 Science > 540 Chemistry & allied sciences
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	12320

Abstract (German)

Der breiten Anwendung der Mikrochipelektrophorese für das Hochdurchsatz-Screening, dem Nachweis pharmazeutischer Moleküle oder in der Proteomforschung stehen derzeit der Mangel geeigneter Detektionstechniken wie auch die ökonomische Fertigung von Mikrofluidik-Chips mit günstigen Oberflächeneigenschaften für Proteintrennungen entgegen. Die vorliegende Arbeit liefert innovative Beiträge zur ...

Abstract (German)

Der breiten Anwendung der Mikrochipelektrophorese für das Hochdurchsatz-Screening, dem Nachweis pharmazeutischer Moleküle oder in der Proteomforschung stehen derzeit der Mangel geeigneter Detektionstechniken wie auch die ökonomische Fertigung von Mikrofluidik-Chips mit günstigen Oberflächeneigenschaften für Proteintrennungen entgegen.
Die vorliegende Arbeit liefert innovative Beiträge zur intrinsischen Fluoreszenzdetektion von Biomolekülen sowie der Entwicklung von Mikrofluidik-Bausteinen aus funktionalen bzw. hydrophilen Polymeren.
Detektionsseitig wird die intrinsische Fluoreszenz von kleinen Aromaten und Proteinen untersucht. Diese ermöglicht die empfindliche Detektion ohne vorherige Fluoreszenzmarkierung und kann mittels einzelphotoneninduzierter Fluoreszenz mit Anregung im tiefen UV-Spektralbereich, oder alternativ als zweiphotoneninduzierte Variante mit Anregung im sichtbaren Bereich erfolgen.
Die Auswirkung der Anregungsintensität im Hinblick auf die erreichbare Empfindlichkeit bei 266 nm ist sehr analytspezifisch. Während für die untersuchten homozyklischen Aromaten die Nachweisempfindlichkeit mit steigender Anregungsintensität zunimmt, sinkt die Sensitivität
für indolhaltige Moleküle oberhalb von 100 µW Anregungsleistung durch Photobleichen wieder ab. Die Photostabilität von proteingebundenem Tryptophan ist deutlich höher als die von freiem Tryptophan. So konnte für elektrophoretisch getrennte Proteine ein Detektionslimit von jeweils 5 µg/mL erreicht werden.
Potentielle Anwendungen der intrinsischen Fluoreszenzdetektion werden am Beispiel der Analyse psychoaktiver Wirkstoffe aus einer Banane sowie an der der effizienten Trennung und Detektion von Eiklar-Proteinen demonstriert.
Für die zweiphotoneninduzierte native Fluoreszenz wird das Potenzial im Hinblick auf die Verwendung kostengünstiger Chipmaterialien evaluiert. Zu diesem Zweck wird ein Mikrochipelektrophorese-System mit Anregung bei 420 nm vorgestellt. Die Detektion kleiner Aromaten ist sowohl in UVC-transparentem Quarz- wie auch in UVC-intransparentem Glas- Chips möglich. Im direkten Vergleich der Daten ist der Messuntergrund im Glas leicht erhöht.
Sogar in UVB-intransparenten PMMA-Chips ist die Detektion potenziell möglich, allerdings wirkt der Chip wie ein Hochpassfilter, so dass Emissionslicht unterhalb von 360 nm durch das Polymermaterial absorbiert wird. Von den Modellanalyten weist das Tryptophan die größte Emission im UVA-Bereich auf, daher wird Tryptophanlösung in PMMA detektiert.
Durch die Miniaturisierung leistungsstarker Laser bzw. die bessere Verfügbarkeit von LEDs im UVC-Bereich werden Detektoren für die native Fluoreszenzdetektion von Proteinen mehr Bedeutung erlangen. Die Implementierung zeitkorrellierter und wellenlängenselektiver
Datenakquisitionstechniken würde die Signalidentifizierung in komplexen Realproben erleichtern und die Sensitivität durch Diskriminierung des Hintergrundes weiter steigern.

Im Bereich der funktionalen Polymere liefert diese Arbeit tiefere Einblicke zum Verständnis der Oberflächenhydrophilierung von Polyvinylacetat, welches sich an der Oberfläche in kovalent gebundenen Polyvinylalkohol konvertieren lässt. Da eine direkte Fertigung von Polyvinylalkohol-Chips bis heute nicht möglich war, sollten so die vorteilhaften Eigenschaften von Polyvinylalkohol-Oberflächen für die MCE genutzt werden. Die Eignung der hydrophilierten Chips liegt jedoch aufgrund schlechter physikalischer Eigenschaften des Materials deutlich hinter den Erwartungen.
Aus diesem Grund wird die softlithographische Strukturierung und Fertigung
mikrofluidischer Chips in Schichtbauweise erprobt (�Sandwich�-Chips). Dieses Verfahren ermöglicht erstmals die direkte Herstellung von Chips mit strukturierter Polyvinylalkohol-Schicht, welche thermisch immobilisiert werden kann. Vorteile dieser Sandwich-Chips sind gute Transmissionseigenschaften bis 250 nm sowie die effiziente Ableitung Joulescher Wärme im Vergleich zum Polymer-Vollmaterial.
Das direkte Herstellen hydrophiler Polymerchips für die Analyse biologischer
Makromoleküle ist ein Novum, welches mit bestehender Infrastruktur in vielen
Forschungslabors durchgeführt werden kann. Damit eignet es sich zum rapid prototyping und ist eine ökonomische Alternative zu nachträglich oberflächenmodifizierten Glas-Chips. Die Messung von Applikationen in diesen Bausteinen steht noch aus.
Die Substituierung von konventionellem Glas zu fused silica als Trägermaterial sollte die Detektion von Proteinen mittels nativer Fluoreszenzdetektion mit Anregung im tiefen UV in Sandwich-Chips ermöglichen.

Translation of the abstract (English)

This work is about contributions to microchip electrophoresis with respect to label-free fluorescence detection techniques of biological relevant molecules and the development of microfluidic chips made of functional hydrophilic polymers. The native fluorescence detection of proteins as well as of small aromatics with laser excitation at 266 nm for single photon excitation and 420 nm for two ...

Translation of the abstract (English)

This work is about contributions to microchip electrophoresis with respect to label-free fluorescence detection techniques of biological relevant molecules and the development of microfluidic chips made of functional hydrophilic polymers.
The native fluorescence detection of proteins as well as of small aromatics with laser excitation at 266 nm for single photon excitation and 420 nm for two photon excitation is evaluated.
The variation of excitation intensity at 266 nm with respect to individual analytes is discussed. To show real world applications, a protein mixture and a banana extract are analysed.
Utilising two photon excitation enables the detection of small aromatics even in UV-C intransparent borofloat glass and potentially in UV-C intransparent polymers (PMMA).

Potential hydrophilic polymers as poly(vinyl acetate) and poly(vinyl butyral) are used to manufacture microfluidic chips, which can be converted into poly (vinyl alcohol).
Furthermore the softlithographic microstructuring of "sandwich chips" containing of a polymer film between two glass slides is shown. This design enables high quality optical chips made directly from a microstructured hydrophilic poly(vinyl alcohol) layer. Advantageous of this design are good optical transmission properties and the ability to reduce Joule heating due to a high heat conductivity compared to bulk polymers.

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