Abstract (German)
In der vorliegenden Arbeit wurde eine �bead�-basierte Killer-artifizielle-antigenpräsentierende Zelle (KaAPC) generiert, die mittels des gebundenen HLA-A2-Ig Dimers und des anti-Fas Antikörpers, zur antigenspezifischen Ausschaltung von pathogenetisch relevanten antigenspezifischen CD8+ T-Zellen befähigt ist.
Nach anfänglicher Optimierung der Kulturbedingungen und der Ausschaltung der Effekte ...
Abstract (German)
In der vorliegenden Arbeit wurde eine �bead�-basierte Killer-artifizielle-antigenpräsentierende Zelle (KaAPC) generiert, die mittels des gebundenen HLA-A2-Ig Dimers und des anti-Fas Antikörpers, zur antigenspezifischen Ausschaltung von pathogenetisch relevanten antigenspezifischen CD8+ T-Zellen befähigt ist.
Nach anfänglicher Optimierung der Kulturbedingungen und der Ausschaltung der Effekte freien Peptids auf antigenspezifische CD8+ T-Zellkokulturen, wurden verschiedene KaAPC-Phänotypen hergestellt. Hierzu wurden unterschiedliche Mengen an HLA-A2-Ig Dimer Molekülen und anti-Fas Antikörpern auf der Oberfläche von paramagnetischen Epoxybeads immobilisiert. Die anschließende Evaluierung ergab einen optimalen, zur antigenspezifischen Eliminierung von CD8+ T-Zellen befähigten, KaAPC-Phänotyp mit definierten Mengen an HLA-A2-Ig Dimer Molekülen und gleichzeitig gebundenem anti-Fas Antikörper. Dieser wurde durchflusszytometrisch charakterisiert und sowohl im Mart-1 als auch im CMVpp65 humanen, antigenspezifischen CD8+ T-Zellmodellsystem funktionell untersucht. Durch die Bestimmung der Apoptoseinduktion in humanen antigenspezifischen HLA-A2 restringierten CD8+ T-Zellen nach Kokultur mit unterschiedlich beladenen KaAPC konnte gezeigt werden, dass KaAPC, beladen mit dem korrespondierenden Peptid, CD8+ T-Zellen antigenspezifisch depletieren können. Darüber hinaus ergaben weitere funktionelle Experimente, dass die Effizienz der KaAPC proportional zur eingesetzten Menge war und, dass die antigenspezifische Depletion schon nach 30 min Kontaktzeit zwischen KaAPC und CD8+ T-Zelle ausgelöst wurde. Ebenso konnte kein klassischer, aktivierungsinduzierter Zelltod (AICD) in den antigenspezifischen CD8+ T-Zellen nach Kokultur mit KaAPC nachgewiesen werden. Antigenspezifische CD8+ T-Zellen exprimierten weder CD107a noch typische Effektorzytokine wie TNF-alpha nach Kontakt mit KaAPC. Kokulturen von KaAPC und antigenspezifischen CD8+ T-Zellen unter Zugabe eines neutralisierenden anti-TNF-alpha Antikörpers zeigten keinerlei Auswirkung auf die durch KaAPC hervorgerufene Apoptoseinduktion. Kokulturen mit Kontrollbeads, die mit gleichen Mengen an HLA-A2-Ig Dimer beschichtet waren, jedoch keinen anti-Fas Antikörper besaßen, zeigten keine Apoptoseinduktion, die über den in den unstimulierten T-Zellkulturen gemessenen Hintergrund hinausging. Diese Ergebnisse zeigten deutlich, dass die erfolgreiche antigenspezifischen Depletion von CD8+ T-Zellen sowohl vom Vorhandensein, als auch von der Stärke eines antigenspezifischen (HLA-A2-Ig Dimer) und eines Apoptose induzierenden Signals (anti-Fas Antikörper) abhängt.
Um die potentielle therapeutische Anwendbarkeit der KaAPC weiter zu untermauern, wurde untersucht, ob diese antigenspezifische CD8+ T-Zellen auch aus einem Gemisch unterschiedlicher T-Zellen mit verschiedenen Antigenspezifitäten depletieren werden konnten. Hierzu wurde unter zur Hilfenahme der beiden Membranfarbstoffe PKH67 und PKH26 und unter gleichzeitiger Verwendung von Annexin V und 7-ActinomycinD ein neuer durchflusszytometrischer Test entwickelt. Dieser erlaubte die gleichzeitige, voneinander getrennte Evaluation von Apoptoseraten in unterschiedlichen T-Zellpopulationen innerhalb desselben Ansatzes. Durch die Anwendung dieser neuen Methode konnte der Beweis erbracht werden, dass KaAPC antigenspezifische CD8+ T-Zellen auch aus einem heterogenen Gemisch autologer Fas+ CD8+ T-Zellen mit unterschiedlichen Antigenspezifitäten eliminieren können.
Für den in dieser Arbeit entwickelten, sowohl phänotypisch, als auch funktionell charakterisierten KaAPC-Phänotyp konnte somit der �proof of concept� erbracht werden. Da KaAPC CD8+ T-Zellen antigenspezifisch eliminieren, stellen diese eine neue, vielversprechende Möglichkeit zur Modulation von T-Zellvermittelten Immunantworten da. Jedoch müssten vor einem potentiellen Einsatz der KaAPC-Technologie in der Klinik zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen, Transplantatabstoßungsreaktionen oder chronischen Infekten die in vivo Eigenschaften der KaAPC sorgfältig evaluiert werden.
Translation of the abstract (English)
Several cell based immunotherapy strategies have been developed to specifically modulate T cell-mediated immune responses. These methods frequently rely on the utilization of tolerogenic cell based-antigen presenting cells (APC). However, APC are highly sensitive to cytotoxic T cell responses, thus, limiting their therapeutic capacity.
Here a novel bead-based approach to modulate T cell ...
Translation of the abstract (English)
Several cell based immunotherapy strategies have been developed to specifically modulate T cell-mediated immune responses. These methods frequently rely on the utilization of tolerogenic cell based-antigen presenting cells (APC). However, APC are highly sensitive to cytotoxic T cell responses, thus, limiting their therapeutic capacity.
Here a novel bead-based approach to modulate T cell responses in an antigen-specific fashion is discribed. Aim of the study was the generation of Killer artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) by coupling an apoptosis-inducing anti-Fas (CD95)-IgM mAb together with HLA-A2-Ig molecules onto beads. The presented experimental data prove that KaAPC deplete targeted antigen-specific T cells in a Fas/FasL dependent fashion. T cell depletion in co-cultures is rapidly initiated (30 min), dependent on the amount of KaAPC and independent of activation induced cell death (AICD). All in 
proof of concept for KaAPC mediated antigen-specific depletion of human primary antigen-specific CD8+ T lymphocytes could be demonstrated.
KaAPC represent a novel technology that can control T cell mediated immune responses, and therefore, has potential for use in treatment of autoimmune diseases and allograft rejection.
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