Mouse models targeted for the tissue inhibitor of metalloproteinases-3 (TIMP3) - molecular and functional dissection of Sorsby fundus dystrophy (SFD) - University of Regensburg Publication Server

URN to cite this document:: urn:nbn:de:bvb:355-epub-123907
DOI to cite this document:: 10.5283/epub.12390

Fogarasi, Marton

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Date of publication of this fulltext: 18 Feb 2010 15:13

Details

Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Open Access Type:	Primary Publication
Date:	18 February 2010
Referee:	Prof. Dr. Rainer Deutzmann and Prof. Dr. Bernhard Weber
Date of exam:	3 December 2009
Institutions:	Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Biochemie I > Prof. Dr. Rainer Deutzmann
Keywords:	TIMP-3, Matrix metalloproteinases, Sorsby fundus dystrophy, enzymatic inhibition
Dewey Decimal Classification:	500 Science > 570 Life sciences
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	12390

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Abstract (English)

Abstract (English)

Sorsby fundus dystrophy (SFD) is an autosomal dominant disorder of the central retina (Sorsby et al., 1949). It is characterized by subretinal neovascularization, atrophy of the retinal pigment epithelium and the choriocapillaris. It is a progressive disorder leading ultimately to blindness. Mutations in the TIMP3 molecule have been linked to SFD (Weber et al., 1994). So far, several point mutations have been identified in the TIMP3 molecule, all localized at the C-terminal domain of the inhibitor, the majority of which result in a single unpaired cysteine residue in the mature protein. TIMP3 belongs to a family of secreted proteins comprising four members (TIMP1, -2, -3, -4). TIMP3 is ECM (extracellular matrix) bound inhibitor with a molecular mass of 24 kDa having 12 conserved Cys residues consisting of two domains which fold independently with 3 disulfide bonds in each domain. TIMP3 is a multifunctional protein involved in the inhibition of matrix metalloproteinases (MMPs) (Murphy et. al., 1994). It can block the TACE (tumour necrosis factor (TNF)-alpha converting enzyme) (or ADAM17 - a disintegrin and metalloproteinase) mediated ectodomain shedding of pro-TNF- (Amour et al., 1998), Syndecan-1 and Syndecan-4 (Fitzgerald et al., 2000), L-selectin (Borland et al., 1999), and interleukin-6 receptor (Hargreaves et al., 1998). TIMP3 is also involved in the inhibition of the ADAMTSs (a disintegrin-like and metalloproteinase with thrombospondin type 1 motif) especially ADAMTS4, ADAMTS5 (Kashiwagi et al., 2001) and ADAMTS2 (Wang et al., 2006). TIMP3 also blocks angiogenesis by binding to VEGFR2 (vascular endothelial growth factor receptor 2) (Qi et al., 2003) and also interacts with EFEMP1 (epithelial growth factor-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1) (Klenotic et al., 2004). TIMP3 is unique among the TIMPs in that it can inhibit TACE mediated TNF- shedding. We have measured TACE activity in liver extracts from mice deficient for the TIMP3 gene using cleavage of a fluorogenic substrate and found increased TACE activity. We were also interested to analyse the influence of the SFD mutation on the inhibition of TACE activity. The S156C mutation in the C-terminal domain of TIMP3 does not lead to significant modification of the inhibitory activity towards TACE as measured in this assay. Another biological function of TIMP3 is its ability to block ADAMTS4/ADAMTS5 (aggrecanase-1, aggrecanase-2) and MMPs mediated cleavage of aggrecan (Kashiwagi et al., 2001). TIMP3 influence on Aggrecan cleavage can be monitored by so-called neoepitope antibodies – which recognize the newly created epitope after cleavage of the aggrecan by ADAMTS4/ADAMTS5 or MMPs. In a cell-based ELISA using chondrocytes it was found that cleavage activity of ADAMTS4/ADAMTS5 and MMPs towards aggrecan are not affected either in TIMP3 knock-out (KO) chondrocytes or S156C-TIMP3 knock-in (KI) chondrocytes compared to WT counterparts. It has been also demonstrated that TIMP3 is able to block angiogenesis by competing with VEGF for binding to VEGFR2 (Qi et al., 2003). We have also used recombinant proteins to analyse the antiagiogenic property of TIMP3 via its known function of competing with VEGF ligand for its receptor (VEGFR2). The results demonstrate that the S156C mutation in the TIMP3 molecule does not have a significant effect on its capacity to bind VEGFR2 compared to WT recombinant protein. As the pathomechanism of SFD is still unknown it seemed reasonable to search for new interacting partners which might help gain insight into the molecular basis of the disease. In this context, the ability of TIMP3 to bind several different types of collagens was tested. In an ELISA, recombinant TIMP3 was able to bind to five different types of collagens in a concentration dependence manner. In parallel, TIMP3 interacted with BSA and another unrelated protein (TTR), indicating that the interactions are apparently unspecific. These interactions are mediated by the C-terminal domain of TIMP3. Cysteine residues are required for the formation of disulfide bonds which stabilize the folded conformation of proteins (Raina et. al., 1997). Therefore, a free cysteine residue in the TIMP3 molecule could potentially disturb folding of the protein. To analyse this hypothesis we have performed western blotting and detected higher molecular weight complexes caused by intermolecular disulfide bonds. As fibroblasts from the S156C KI mouse were available we quantified the amount of mutant TIMP3 in heterozygous and homozygous immortalized cell lines. ELISA results showed increased amounts of the mutant protein compared to the WT in both the ECM and cells. We next tested if the accumulation of mutant protein is due to increased resistance of the misfolded protein to proteolytic degradation. TIMP3 turnover in the ECM, determined by ELISA, revealed that S156C-TIMP3 mutant does indeed have a slower turnover compared to the WT. These results indicate that the pathomechanism of SFD is not due to a loss-of-function, but rather a toxic gain-of-function caused by accumulation of misfolded mutant TIMP3 in the ECM. Therefore, it is reasonable to conclude that the oligomeric form of TIMP3 is the major cause of the SFD disorder. This would classify SFD in the category of conformational diseases specific for the neurodegenerative disorders.

Translation of the abstract (German)

Sorsby Fundusdystrophie (SFD) ist eine autosomal dominante Erkrankung der zentralen Retina (Sorsby et al., 1949). Sie zeichnet sich durch subretinale Neovaskularisation, Atrophie des retinalen Pigmentepithels und der Choriokapillaris aus. Es ist eine Krankheit mit progressiven Verlauf, die letztendlich zu Blindhheit führt. Mutationen im TIMP3 Molekül werden mit SFD in Verbindung gebracht (Weber et al., 1994). Bisher wurden mehrere Punktmutationen in TIMP3 identifiziert, alle in der C- terminalen Domäne des Inhibitors. Die Mehrheit dieser resultiert in einem einzelnen ungepaarten Cysteinrest im reifen Protein. TIMP3 gehört zu einer Familie von sekretierten Proteinen bestehend aus vier Mitgliedern (TIMP1, -2, -3 und -4). TIMP3, ein EZM (Extrazelluläre Matrix)- gebundener Inhibitor mit einem Molekulargewicht von 24 kDa, besitzt 12 konservierte Cysteinreste und besteht aus zwei Domänen, die sich unabhängig falten mit 3 Disulfidbrücken in jeder Domäne.
TIMP3 ist ein multifunktionelles Protein, welches eine Rolle spielt in der Inhibition von Matrixmetalloproteasen (MMPs) (Murphy et al., 1994). Es kann das TACE (Tumor- Nekrose- Faktor (TNF)- alpha konvertierendes Enzym (oder ADAM17- A disintegrin and Metalloproteinase)- vermittelte Ektodomänen- Shedding von pro- TNF- (Amour et al., 1998), Syndekan-1 aand Syndekan- 4 (Fitzgerald et al., 2000), L- Selektin (Borland et al., 1999) und Interleukin-6- Rezeptor (Hargreaves et al., 1998) blockieren. TIMP3 ist des Weiteren beteiligt an der Inhibition der ADAMTSs (a disintegrin- like and metalloproteinase with thrombospondin type 1 motif), insbesondere ADAMTS4, ADAMTS5 (Kashiwagi et al., 2001) und ADAMTS2 (Wang et al., 2006). TIMP3 unterdrückt ebenfalls die Angiogenese durch Bindung an VEGFR2 (vascular endothelial growth factor receptor 2) (Qi et al., 2003) und interagiert mit EFEMP1 (epithelial growth factor- containing fibulin- like extracellular matrix protein 1) (Klenotic et al., 2004).
TIMP3 ist einzigartig unter den TIMPs in der Hinsicht, als dass es TACE- vermitteltes TNF-α Shedding inhibibieren kann. Wir haben die TACE- Aktivität ermittelt in Leberextrakten von TIMP3- defizienten Knockout- Mäusen mit Hilfe der Spaltung eines fluorogenen Substrats und eine erhöhte TACE- Aktivität gemessen. Wir waren auch interessiert daran, den Einfluss der SFD Mutation auf die Inhibition der TACE- Aktivität zu bestimmen. Die S156C Mutation in der C- terminalen Domäne von TIMP3 bewirkt keine signifikante Veränderung der inhibitorischen Aktivität gegenüber TACE, wie ermittelt in diesem Assay.
Eine weitere biologische Funktion von TIMP3 ist die Fähigkeit ADAMTS4/ ADAMTS5 (Aggrekanase- 1, Aggrekanase- 2) zu inhibieren und die MMP- vermittelte Spaltung von Aggrekan (Kashiwagi et al., 2001). Der Einfluss von TIMP3 auf Aggrakan- Spaltung kann untersucht werden mit sog. Neoepitop- Antikörpern, die ein neu geschaffenes Epitop erkennen nach Spaltung des Aggrekans durch ADAMTS4/ ADAMTS5 oder MMPs. In einem zellbasierten ELISA mit Chondrocyten wurde beobachtet, dass Spaltungsaktivität von ADAMTS4/ ADAMTS5 und MMPs nicht beeinflusst sind in TIMP3 knockout (KO)- Chondrocyten oder S156C- TIMP3 knock- in (KI) Chondrocyten verglichen mit ihrem WT Gegenstück.
Es wurde ebenfalls gezeigt, dass TIMP3 in der Lage ist Angiogengese zu blockieren/ inhibieren durch Kompetition mit VEGF um Bindung an VEGFR2 (Qi et al., 2003). Wir haben rekombinante Proteine genutzt, um die antiangiogene Wirkung von TIMP3 über die bekannte Funktion der Kompetition mit VEGF- Ligand um den Rezeptor VEGFR2 zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigen, dass die S156C Mutation im TIMP3 Molekül keinen signifikanten Effekt auf die Kapazität VEGFR2 zu binden hat, verglichen mit WT Protein.
Da der Pathomechanismus von SFD noch unbekannt ist, schien es vernünftig, nach neuen Interaktionspartnern zu suchen, die helfen könnten Einsicht zu gewinnen in die molekularen Grundlagen der Krankheit. In diesem Zusammenhang wurde die Fähigkeit TIMP3s getestet verschiedene Typen von Kollagen zu binden. In einem ELISA war rekombinantes TIMP3 in der Lage fünf unterschiedliche Kollagen- Typen konzentrationsabhängig zu binden. Gleichzeitig interagierte TIMP3 mit BSA und einem unverwandten Protein (TTR), was darauf hindeutet, dass die Interaktionen unspezifisch sind. Diese Interaktionen werden mediiert durch die C- terminale Domäne von TIMP3.
Cysteinreste werden benötigt für die Formation von Disulfidbrücken, welche die gefaltete Konformation des Proteins stabilisieren (Raina et al., 1997). Daher könnte ein freier Cysteinrest im TIMP3 Molekül potentiell die Faltung des Proteins beeinträchtigen. Um diese Hypothese zu untersuchen, haben wir Western Blots durchgeführt und Komplexe mit höherem Molekulargewicht gefunden, was auf intermolekulare Disulfidbrücken zurückzuführen ist. Da Fibroblasten der S156C KI-Maus zur Verfügung standen, quantifizierten wir die Menge von mutiertem TIMP3 in heterozygoten und homozygoten immortalisierten Zelllinien. ELISA-Ergebnisse zeigten eine gesteigerte Expression des mutierten Proteins verglichen mit dem Wildtyp sowohl in der extrazellulären Matrix als auch in Zellen. Als nächstes testeten wir, ob die Akkumulation des mutierten Proteins auf gesteigerter Resistenz des missgefalteten Proteins gegenüber proteolytischer Degradation beruht. Mittels ELISA wurde gezeigt, dass die S156C-TIMP3-Mutante im Vergleich zum Wildtyp in der Tat einen langsameren Turnover in der EZM besitzt.
Diese Ergebnisse zeigen, dass der Pathomechanismus von SFD nicht auf einem Funktionsverlust beruht, sondern eher auf einem toxischen Funktionsgewinn, ausgelöst durch die Akkumulation von missgefaltetem mutiertem TIMP3 in der extrazellulären Matrix. Daher lässt sich folgern, dass die oligomere Form von TIMP3 der Hauptgrund der Erkrankung ist. Danach müsste SFD in die Kategorie der konformationellen Erkrankungen eingeordnet werden, die spezifisch ist für neurodegenerative Erkrankungen.

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