Function of the upstream activating factor in chromatin structure organization and transcriptional regulation at the yeast ribosomal DNA

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Götze, Hannah

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Date of publication of this fulltext: 20 Apr 2010 11:25

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Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Date:	20 April 2010
Referee:	Prof. Dr. Herbert Tschochner
Date of exam:	25 January 2010
Institutions:	Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Biochemie III > Prof. Dr. Herbert Tschochner
Keywords:	UAF, rDNA, chromatin, S. cerevisiae
Dewey Decimal Classification:	500 Science > 570 Life sciences
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	12558

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Abstract (English)

Abstract (English)

Chromatin is the template of all processes involved in DNA metabolism in the eukaryotic cell. Accordingly, chromatin is a dynamic structure which changes in its composition and posttranslational modification correlating with the functional state of a genomic locus. An excellent example to study the correlation between transcription and chromatin structure is the ribosomal DNA (rDNA) locus in Saccharomyces cerevisiae. This multicopy gene locus harbors the 35S ribosomal RNA (rRNA) genes which are transcribed by the specialized RNA polymerase I (Pol I). 35S rDNA coexists in two different chromatin states correlating with the transcriptional activity of the genes. Interestingly, RNA polymerase II (Pol II) cannot access the rDNA locus and transcription of Pol II-dependent reporter genes within the rDNA is silenced. The upstream activating factor, UAF, plays an important role in determining polymerase specificity and Pol II silencing. A model has been proposed in which UAF nucleates a specific chromatin structure at its binding site within the rDNA promoter region which is then propagated over the entire Pol I-transcribed region. However, an in depth molecular characterization of the UAF-dependent rDNA chromatin structure was missing so far.
The aim of this study was to analyze the role of UAF in the establishment of rDNA chromatin structure to test the predictions made by the above model. Therefore rDNA chromatin was analyzed in different mutant strains by three independent methods investigating DNA accessibility and protein composition. The data demonstrate that UAF is an important determinant of 35S rDNA chromatin structure. Deletion of UAF subunits leads to a drastic reorganization of rDNA promoter chromatin. In the absence of UAF flanking regions of the promoter proximal binding site for the Reb1 protein become accessible for binding of Pol II and III and associated transcription factors, and may be sites of transcription initiation in these strains. The observed chromatin alterations extend throughout the 35S rRNA coding sequence. Importantly, none of the above changes can be provoked by short term inactivation of Pol I transcription demonstrating that the alterations are not a consequence of the reduced Pol I transcription levels in the mutant strains. Furthermore, it was demonstrated that the integrity of the UAF complex is required for the association of the silent information regulator Sir2 with the rDNA locus, which can explain defective Pol II reporter gene silencing upon deletion of UAF components.
Taken together the analyses shed light on how UAF organizes rDNA chromatin determining RNA polymerase specificity at the 35S rDNA promoter and rDNA silencing of Pol II transcription. The obtained results provide a solid molecular basis for earlier observations suggesting that a single factor like UAF can be a mediator between transcriptional activity and chromatin structure of a genomic locus.

Translation of the abstract (German)

Der Upstream Activating Factor UAF spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation der Transkription der ribosomalen RNA Gene durch Polymerase I in S. cerevisiae. UAF ist ein Multiproteinkomplex bestehend aus den 6 Untereinheiten Rrn5, Rrn9, Rrn10, Uaf30, und den Histonen H3 und H4. Die Bindung von UAF an den rDNA Promotor stimuliert die Transkription der rRNA Gene. Gleichzeitig determiniert UAF die Spezifität des 35S rDNA Promoters für RNA Pol I. So konnte gezeigt werden, dass Deletionen von UAF Untereinheiten zu einer Veränderung der Transkription am rDNA Lokus führen. Die Deletion der UAF Untereinheit UAF30 führt dazu, dass die rRNA Gene nicht mehr nur von Polymerase I, sondern auch von Polymerase II transkribiert werden. Die Transkriptionsrate durch Polymerase I ist in diesen Stämmen stark reduziert. Die Transkription durch Pol II startet an einem kryptischen Promotor stromaufwärts des Pol I Promotors. Die Deletion einer der UE Rrn5, Rrn9 oder Rrn10 führt dazu, dass die rRNA Gene nur noch von Polymerase II transkribiert werden. In diesen UAF Mutanten ist die Transkription durch Polymerase I komplett inhibiert.
UAF spielt demnach eine wichtige Rolle bei der spezifischen Transkription der rRNA Gene durch Polymerase I. Der Faktor aktiviert die Pol I Transkription und unterdrückt gleichzeitig die Pol II Transkription am 35S rDNA Lokus.Es wurde ein Modell postuliert, nachdem UAF die Chromatinstruktur am rDNA Lokus determiniert und dadurch den Zugang der Polymerasen I und II reguliert.
Diese Arbeit befasste sich mit der Aufklärung der molekularen Grundlagen für das genannte Modell.
Dazu wurde mit MNase-Verdauen und Psoralen-Analysen untersucht, wie die Anwesenheit bzw. Abwesenheit von UAF die Chromatin Struktur am rDNA Lokus beeinflusst. Dabei konnten starke Veränderungen in der Chromatinstruktur in Abwesenheit von UAF detektiert werden. Der Multiproteinkomplex spielt demnach eine wichtige Rolle bei der Etablierung einer spezifischen Chromatinstruktur am rDNA Lokus. Des weiteren sollte mit der Chromatin Endogenous Cleavage (ChEC) Methode untersucht werden, wie UAF den Zugang zur rDNA Promotorregion für Transkriptionsfaktoren und Polymerasen reguliert. Es konnte dabei gezeigt werden, dass UAF den Zugang zur rDNA Promotorregion reguliert.
Außerdem konnten die Daten zeigen, dass UAF über die Rekrutierung von Sir2 die Chromtinstruktur am gesamten rDNA Lokus determiniert.

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