| License: Publishing license for publications including print on demand (20MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-125591
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.12559
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 18 January 2011 |
| Referee: | Prof. Dr. Reinhard Sterner |
| Date of exam: | 26 January 2010 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Reinhard Sterner |
| Interdisciplinary Subject Network: | Not selected |
| Keywords: | Glucocorticoid-Rezeptor, gelenkte Evolution, Protein-Design, Protein-Stabilität, GFP, FACS |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 12559 |
Abstract (German)
Zur biophysikalischen Charakterisierung oder zur Aufklärung der Struktur eines Proteins muss dieses rekombinant in löslicher Form und in großen Mengen produziert werden. Die intrinsische Instabilität vieler eukaryotischer Proteine macht dies jedoch oft sehr schwierig bzw. gänzlich unmöglich. Obwohl dieses Problem in manchen Fällen durch Variation der Expressions- und/oder Reinigungsbedingungen ...
Abstract (German)
Zur biophysikalischen Charakterisierung oder zur Aufklärung der Struktur eines Proteins muss dieses rekombinant in löslicher Form und in großen Mengen produziert werden. Die intrinsische Instabilität vieler eukaryotischer Proteine macht dies jedoch oft sehr schwierig bzw. gänzlich unmöglich. Obwohl dieses Problem in manchen Fällen durch Variation der Expressions- und/oder Reinigungsbedingungen umgangen werden kann, ist in vielen Fällen eine Optimierung der Aminosäuresequenz mittels Mutagenese erforderlich.
Bei Kenntnis der Struktur eines Proteins oder bei Vorliegen eines zuverlässigen Modells kann die Optimierung durch rationales Design erfolgen. Im ersten Projekt dieser Arbeit wurde auf der Basis mehrerer Homologie-Modelle die Löslichkeit der N-terminalen Domäne der humanen Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin Typ 9 durch den Austausch 15 hydrophober Aminosäuren der Proteinoberfläche gegen hydrophilere Reste signifikant erhöht: die Ausbeute an gereinigtem Protein stieg auf das Fünffache des Ausgangswertes an und die zur Ausfällung von 50 % des Proteins benötigte Konzentration an Ammoniumsulfat erhöhte sich von 0,23 M auf 0,52 M. Allerdings war die optimierte Proteinvariante etwas weniger stabil gegenüber chemischer Denaturierung: die zur Entfaltung von 50 % des Proteins benötige Konzentration an Harnstoff erniedrigte sich von 3,75 M auf 3,02 M. Diese Ergebnisse zeigen, dass Löslichkeit und konformationelle Stabilität eines Proteins nicht in jedem Fall korreliert sein müssen.
In Abwesenheit struktureller Information kann die Aminosäuresequenz eines Proteins mittels gelenkter Evolution optimiert werden. Dabei wird zunächst durch Zufallsmutagenese ein großes Repertoire an Proteinvarianten erzeugt, aus dem anschließend durch effiziente Selektions- oder Screening-Verfahren diejenigen mit den besten Eigenschaften isoliert werden können.
Im zentralen zweiten Teil dieser Arbeit wurde gelenkte Evolution zur Erhöhung der Löslichkeit und Stabilität der Ligand-Bindungsdomäne des humanen Glucocorticoid-Rezeptors (hGR-LBD) durchgeführt, wobei fusioniertes grün fluoreszierendes Protein (GFP) als Reporter diente. GFP weist ein leicht messbares Fluoreszenzsignal auf, dessen Intensität von der Löslichkeit bzw. Stabilität des fusionierten hGR-LBD abhängt und im Hochdurchsatz Screening-Verfahren mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) ausgelesen werden kann. Zunächst wurden durch Zufallsmutagenese mittels error prone PCR zwei plasmidkodierte hgr-lbd-egfp Genbanken mit hoher bzw. niedriger Mutationsfrequenz hergestellt. Anschließend wurden die mit den beiden Banken transformierten und gemischten E. coli Zellen insgesamt acht FACS-Anreicherungsrunden unterzogen, wobei schrittweise nach höherer GFP-Fluoreszenz im Hochdurchsatz (> 10.000 Zellen/Sekunde) sortiert wurde. Hierdurch gelang die Isolierung von insgesamt fünf hGR-LBD Varianten (vier aus Anreicherungsrunde 5 und eine aus Anreicherungsrunde 8), die alle aus der hochmutagenen Genbank stammten und insgesamt 30 unterschiedliche Aminosäurenaustausche enthielten.
Von diesen 30 Austauschen wurden 14 einzeln getestet, wobei vier Mutationen identifiziert werden konnten, welche, ähnlich wie die in der Literatur beschriebene Mutation F602S (Bledsoe et al., 2002), zu einer Erhöhung der Fluoreszenz des fusionierten GFP und zu einem Anstieg der Löslichkeit von hGR-LBD in Abwesenheit von GFP führen. Die Kombination der vorteilhaften Mutationen zeigte, dass die Effekte der einzelnen Austausche auf die Fluoreszenz und die Löslichkeit additiv sind und ein linearer Zusammenhang zwischen den beiden Parametern besteht. Die erhöhte Löslichkeit der optimierten hGR-LBD-Variante ermöglichte ihre Reinigung mit hoher Ausbeute und die Untersuchung ihrer konformationellen Stabilität mittels thermischer Auffaltung. Es zeigte sich, dass alle Austausche den apparenten Schmelzpunkt sowohl mit gebundenem Agonisten Dexamethason als auch (mit einer Ausnahme) mit gebundenem Antagonisten Mifepriston erhöhen und ein linearer Zusammenhang zwischen der Fluoreszenz von fusioniertem GFP und der thermischen Stabilität von hGR-LBD in Abwesenheit von GFP besteht. Die Einführung der in dieser Arbeit identifizierten vorteilhaften Mutationen führt zu einer 26-fach verbesserten Reinigungsausbeute des Proteins aus der löslichen Zellfraktion von E. coli. Darüber hinaus wird durch die Austausche der apparente Schmelzpunkt sowohl der Agonist- als auch der Antagonist-Konformation um ca. 8 °C erhöht.
Im Laufe des FACS-basierten Hochdurchsatz-Screenings wurden verschiedene Artefakte beobachtet, welche die Isolierung optimierter hGR-LBD Varianten erschwerten. Die Ursachen dieser Artefakte, die sowohl auf Gen- als auch auf Proteinebene auftreten können, wurden aufgeklärt und Möglichkeiten zu ihrer Identifizierung und Umgehung erarbeitet.
Drei der stabilisierenden Mutationen ermöglichten es, in Kooperation mit F.Hoffmann – LaRoche (Basel) die Röntgenkristallstruktur der homologen GR-LBD aus der Maus (mGR-LBD; 95,3 % Sequenz-Identität mit hGR-LBD) mit einer verbesserten Auflösung von 1,5 Å anstelle der bisher erzielten 1,9 Å aufzuklären. Durch die Analyse der Struktur konnten bisher nicht bekannte atomare Details sichtbar gemacht und der Effekt der stabilisierenden Mutationen erklärt werden. In weiterführenden Arbeiten können nun die optimierten GR-LBD-Varianten zur Strukturaufklärung des Proteins mit neuen Ligand-Leitstrukturen verwendet werden, was bei der Entwicklung pharmazeutischer Wirkstoffe von Nutzen sein kann.
Im dritten Teil der Arbeit wurde ein in meiner Diplomarbeit begonnenes Projekt zur Stabilisierung des artifiziellen (ba)8-Barrel Proteins HisF-C*C, welches aus zwei identischen, fusionierten C-terminalen Hälften von tmHisF (Synthase-Untereinheit der Imidazolglycerinphosphat-Synthase aus Thermotoga maritima) besteht, mit der Aufklärung einer hoch aufgelösten Röntgenkristallstruktur zum vorläufigen Abschluss gebracht. Dieses Projekt resultierte in zwei Publikationen (Seitz et al., 2007; Höcker et al., 2009), die sich im Anhang zu dieser Arbeit finden.
Translation of the abstract (English)
Structure determination by X-ray crystallography requires the production of large amounts of soluble and stable protein. However, the generation of human protein domains in Escherichia coli is often hampered by a low expression level and poor solubility of the recombinant polypeptide chains. A promising approach to overcome these problems is to increase stability and solubility by random ...
Translation of the abstract (English)
Structure determination by X-ray crystallography requires the production of large amounts of soluble and stable protein. However, the generation of human protein domains in Escherichia coli is often hampered by a low expression level and poor solubility of the recombinant polypeptide chains. A promising approach to overcome these problems is to increase stability and solubility by random mutagenesis and screening with the help of reporter proteins. Here we report the optimization of the ligand-binding domain of human glucocorticoid receptor (hGR-LBD), which is produced almost exclusively in insoluble form in E. coli, by using eGFP as fused folding reporter. In order to screen a large repertoire of mutants we performed several rounds of fluorescence-activated cell-sorting (FACS). In total four beneficial mutations could be identified, which lead individually and additively to improved properties. Combining them leads to a 26-fold increase of the purification yield of hGR-LBD and stabilizes both the agonist and the antagonist conformation of the protein by about 8 °C. The GR-LBD from mouse with three of the discovered mutations was crystallized and its X-ray structure was solved at 1.5 Å resolution, which is significantly better than of previously described crystal structures of GR-LBD. Thus the obtained GR-LBD mutants can be helpful for future co-crystallization experiments of the protein with newly discovered compounds of pharmaceutical relevance. Our results show that large eGFP fusion libraries can be screened by FACS with high sensitivity and efficiency, why this approach is highly recommended for prospective applications using eGFP as folding reporter.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 10:41
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