Merl, Juliane
(2010)
In-vivo- und In-vitro-Charakterisierung von Proteinkomplexen eukaryotischer Ribosomenbiogenesefaktoren.
PhD, Universität Regensburg.
Date of publication of this fulltext: 12 Apr 2010 13:35
Abstract (German)
Zur Synthese eukaryotischer Ribosomen werden mehr als 150 Ribosomenbiogenesefaktoren benötigt, die vorübergehend bei der Bildung neusynthetisierter Untereinheiten mit präribosomalen Partikeln interagieren. Während der letzten Jahre konnten verschiedenste präribosomale Zwischenstufen identifiziert werden, die sich in ihrer Proteinzusammensetzung und ihrem jeweiligen (prä-) rRNA–Gehalt ...
Abstract (German)
Zur Synthese eukaryotischer Ribosomen werden mehr als 150 Ribosomenbiogenesefaktoren benötigt, die vorübergehend bei der Bildung neusynthetisierter Untereinheiten mit präribosomalen Partikeln interagieren. Während der letzten Jahre konnten verschiedenste präribosomale Zwischenstufen identifiziert werden, die sich in ihrer Proteinzusammensetzung und ihrem jeweiligen (prä-) rRNA–Gehalt unterscheiden.
Bei diesem hoch dynamischen und komplexen Vorgang stellt sich grundsätzlich die Frage, in welcher Form die zahlreichen beschriebenen Ribosomenbiogenesefaktoren an präribosomale Partikel assoziieren. Dabei besteht die Möglichkeit der Bindung einzelner Proteine an unabhängigen Bindungsstellen der (prä-) rRNA, der sequenziellen Assoziation einzelner Proteine an bereits gebundene ribosomale Proteine und Biogenesefaktoren oder auch der Assoziation vorgeformter prä-rRNA unabhängiger Proteinmodule. Weiterhin ist bisher auch unklar, ob diese Proteine als Einzelproteine oder im Komplex mit anderen Faktoren im Laufe der Ribosomenreifung von präribosomalen Partikeln abdissoziieren.
In der vorliegenden Arbeit konnte eine systematische Methode etabliert werden, die es ermöglicht, die Existenz prä-rRNA freier Proteinkomplexe von Ribosomenbiogenesefaktoren im Modellorganismus S. cerevisiae in vivo zu analysieren. Dazu wurden die Biogenesefaktoren Noc1p, Nop7p, Rio2p, Enp1p, Rix1p und Arx1p in Abwesenheit von rRNA–Neusynthese affinitätsgereinigt. Die Zusammensetzung assoziierter, ohne prä-rRNA vorliegender Zusammenschlüsse wurde mittels semiquantitativer Massenspektrometrie mit dem jeweiligen Aufbau von präribosomalen Partikeln verglichen, die in Anwesenheit von rRNA–Synthese gereinigt wurden.
Im Zuge dieser Untersuchung konnten die Zusammensetzungen bereits beschriebener rRNA freier Proteinkomplexe bestätigt werden. Dabei handelt es sich um den Rix1p-Ipi1p-Ipi3p-Komplex, den Nop7p-Erb1p-Ytm1p-Komlex und das potentielle Dimer der beiden Proteine Noc1p und Noc2p. Weiterhin konnten in fast allen Fällen neue Komponenten dieser Komplexe identifiziert werden. So scheint Rrp5p, eine Komponente des SSU-Prozessoms, prä-rRNA unabhängig mit dem Noc1p-Noc2p-Komplex zu interagieren und die DEXD/H Box RNA-Helikase Drs1p Teil des Nop7p-Erb1p-Ytm1p-Komplexes zu sein. Diese Komplexe aus LSU-Biogenesefaktoren könnten vermutlich funktionelle Blöcke in der Bildung von prä-60S Partikeln darstellen.
Weiterhin scheint nach Abschalten der rRNA-Synthese in vivo ein Rio2p-Enp1p-Modul mit bis zu fünf weiteren Komponenten zu existieren. Dabei handelt es sich wahrscheinlich eher um einen Komplex, der im Laufe der Ribosomenreifung im Ganzen vom 40S Präribosom abdissoziiert und in Abwesenheit von rRNA-Synthese als reiner Proteinkomplex erhalten bleibt.
Bei dem hier gewählten Ansatz war es im Gegensatz zu vorangegangenen Analysen unwahrscheinlich, dass sich diese Proteinmodule durch ein Zerfallen präribosomaler Partikel ausgebildet hatten. Vielmehr lassen die vorliegenden Ergebnisse vermuten, dass sie in vivo unabhängig von ablaufender Ribosomenbiosynthese existieren und als funktionelle Einheiten mit präribosomalen Partikeln interagieren können oder im Laufe der Ribosomenreifung aus präribosomalen Partikeln als Proteinkomplexe freigesetzt werden.
Zusätzlich zu diesen prä-rRNA unabhängigen Proteinmodulen konnten mehrere Ribosomenbiogenesefaktoren identifiziert werden, die nicht nur an neusynthetisierte große ribosomale Untereinheiten gebunden vorliegen. Arx1p, Tif6p/eIF6, Nmd3p und möglicherweise zusätzlich Rei1p, Alb1p und Lsg1p scheinen auch Assoziation an reife 60S Untereinheiten zu zeigen, die möglicherweise durch Termination der Transkription aus Polysomen freigesetzt werden. Dies lässt vermuten, dass sie eine doppelte Funktion in der Biogenese der großen Untereinheit und deren Stabilität und Recycling während der Translation ausfüllen könnten.
Durch anschließende heterologe Expression der jeweiligen Komponenten der Proteinkomplexe in Insektenzellen konnten die prä-rRNA unabhängigen Interaktionen innerhalb der Noc1p-Noc2p-Rrp5p Proteinkomplexe bestätigt und genauer charakterisiert werden. Auch innerhalb des Rio2p-Enp1p-Moduls konnten direkte Wechselwirkungen identifiziert werden, die jedoch noch genauer untersucht werden müssen. Prinzipiell scheinen Proteinmodule von Ribosomenbiogenesefaktoren mit dieser Methode in der nötigen Menge und Reinheit für anschließende funktionelle und strukturelle Untersuchungen exprimiert und gereinigt werden zu können.
Anfängliche Bindungstests dieser in vitro rekonstituierten Proteinkomplexe an kurze definierte rRNA-Fragmente waren nicht erfolgreich. Somit konnte nicht ermittelt werden, ob und, wenn ja, an welcher Stelle die identifizierten Proteinmodule in der Hefezelle mit präribosomalen Partikeln als vorgeformte Komplexe interagieren können. Da in der Vergangenheit zumindest für Rrp5p bereits eine Bindung an definierte Abschnitte der prä-rRNA nachgewiesen werden konnte, müssen in diesem Zusammenhang gegebenenfalls die Bindungsbedingungen entsprechend angepasst werden.
Grundsätzlich konnten im Rahmen der vorliegenden Arbeit Grundlagen zu weiterführenden Analysen der Architektur von Proteinkomplexen von Ribosomenbiogenesefaktoren und zur Untersuchung deren in vitro Bindung an präribosomale Partikel geschaffen werden, um langfristig einen Einblick in die funktionelle Architektur präribosomaler Partikel zu gewinnen.
Translation of the abstract (English)
Formation of eukaryotic ribosomes requires more than 150 biogenesis factors which transiently interact with the nascent ribosomal subunits. Previously, many pre-ribosomal intermediates could be distinguished by their protein composition and rRNA precursor (pre-rRNA) content.
We purified complexes of ribosome biogenesis factors from yeast cells in which de novo synthesis of rRNA precursors was ...
Translation of the abstract (English)
Formation of eukaryotic ribosomes requires more than 150 biogenesis factors which transiently interact with the nascent ribosomal subunits. Previously, many pre-ribosomal intermediates could be distinguished by their protein composition and rRNA precursor (pre-rRNA) content.
We purified complexes of ribosome biogenesis factors from yeast cells in which de novo synthesis of rRNA precursors was downregulated by genetic means. The protein composition of these largely pre-rRNA free assemblies was compared with the one of analogous pre-ribosomal preparations by semi-quantitative mass spectrometry. The experimental setup minimizes the possibility that the analyzed pre-rRNA free protein modules were derived from (partially) disrupted pre-ribosomal particles and provides thereby strong evidence for their pre-ribosome independent existence.
In support of the validity of this approach (i) the predicted composition of the analyzed protein modules was in agreement with previously described rRNA-free complexes and (ii) in most of the cases new candidate members of reported protein modules could be identified.
The data suggest that Rio2p forms (a) module(s) with Enp1p, Ltv1p, Tsr1p, Krr1p, Hrr25p and Dim1p; that Rrp5 is a member of a Noc1-Noc2 module, and that Drs1p association with a Nop7p-Erb1p-Ytm1p module is enhanced by pre-rRNA, but does not strictly depend on it.
This strengthens the idea that assembly of eukaryotic pre-ribosomal particles can result from transient association of distinct building blocks.
An unexpected outcome of these analyses was that free large ribosomal subunits are associated with a specific set of ribosome biogenesis factors in cells where neo-production of nascent ribosomes was blocked. These data suggest that free 60S ribosomal subunits, neo-synthesized or released from 80S ribosomes during translation termination, are decorated with factors including Arx1p, Tif6p/eIF6, Nmd3p and, eventually, in addition Rei1p, Alb1p and Lsg1p. A dual function in both ribosome synthesis and regulation of LSU recycling during translation would explain the unexpected association of these factors with mature LSUs.
The pre-rRNA independent interactions within the Noc1p Noc2p Rrp5p complex(es) and between members of the Rio2p Enp1p module(s) could be validated and analyzed in more detail by heterologous expression of complex components in insect cells. In general these protein complexes could be expressed and purified with amounts and purity good enough for subsequent functional and structural characterization.
This might generate new fundamentals for a detailed analysis of the architecture of protein complexes involved in ribosome biogenesis and for a better understanding of the functions of these factors and the complexity and dynamics of their association with preribosomal particles.
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