Expression and regulation of liver regeneration associated protein ALR under patho-physiological conditions

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Dayoub, Rania

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Date of publication of this fulltext: 24 Feb 2010 09:16

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Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Open Access Type:	Primary Publication
Date:	1 February 2010
Referee:	Prof. Dr. Armin Buschauer and PD Dr. Thomas Weiß
Date of exam:	6 August 2009
Institutions:	Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical/Medicinal Chemistry II (Prof. Buschauer) Medicine > Lehrstuhl für Chirurgie
Keywords:	Leber , Regeneration , Leberzellkrebs , Proteine , Genregulation , Genexpression , Leberregeneration , ALR , Hepatozellular Karzinoma , Leber , liver regeneration , ALR , hepatocellular carcinoma , liver
Dewey Decimal Classification:	500 Science > 540 Chemistry & allied sciences
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	13099

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Abstract (English)

Abstract (English)

Liver regeneration is a multistep and well-orchestrated process which is initiated by injuries like tissue loss, infectious or toxic insults. It has been shown that expression of the hepatotrophic factor �Augmenter of Liver Regeneration� (ALR) is increased within liver regeneration as well as in liver diseases like cirrhosis and liver carcinoma. The aim of this thesis was to analyze how ALR is expressed, regulated and what impact an altered expression of ALR might have on the liver. Therefore, we investigated the expression of ALR in experimental models of liver injury which resemble hepatic patho-physiological disorders such as liver fibrosis and non-alcoholic steatohepatitis. ALR mRNA expression could be shown to be upregulated independent of different insults and is increased in HCC tissues compared to normal tissues. Furthermore, our results showed that IL-6 rapidly induces the mRNA expression and protein level of ALR in human hepatocytes and hepatoma cells, whereas IL-1 beta reduces the expression levels of ALR. No changes in ALR levels could be observed after stimulation with growth factors suggesting that ALR is regulated only by factors which are known to initiate the process of regeneration. Further, we analyzed the promoter sequence of ALR and identified putative regulatory elements for FOXA2, IL 6 RE BP and C/EBP beta. Using luciferase assays and EMSA, we demonstrated that both IL-6 RE-BP and C/EBP beta could not transactivate/bind to the ALR promoter. In contrast, FOXA2 has been found to regulate the expression of ALR, and this regulation was amplified by simultaneously activation using IL-6. Additionally, ALR promoter exhibits a nearly conserved Nrf2 binding site underlining a hepatoprotective function of ALR against oxidative stress. Using ALR overexpressing HepG2 cells we could not detect an altered proliferation rate neither in vitro nor in vivo. ALR-overexpressing cells displayed an enhanced acquirement to adhere and a significant lower ability to migrate and invade compared to wild type cells. Furthermore, we demonstrated that ALR expression induces the expression of the adhesion molecule E-cadherin and reduces the expression of MMP-3 and SNAIL explaining the modulation of E-cadherin by ALR. In conclusion, in this thesis was shown that ALR plays a role in hepatic regeneration independent of its cause and is regulated by upstream factors of liver regeneration like cytokines. Addionally, it was demonstrated that ALR expression counteracts the epithelial mesenchymal transition (EMT) suggesting that application of ALR represents a promising therapeutical strategy for diseases in which EMT is involved.

Translation of the abstract (German)

Die Leber besitzt eine außergewöhnliche Fähigkeit nach einer Schädigung zu regenerieren. Faktoren wie das Leberregeneration assoziierte Protein �Augmenter of Liver Regeneration� werden bei der Leberregeneration verstärkt exprimiert und sind auch bei Lebererkrankungen wie Zirrhose und hepatozellulärem Karzinom (HCC) erhöht. Die Zielsetzung dieser Arbeit war es, neue Erkenntnisse hinsichtlich der Expression, Regulation und intrazellulären Expression von ALR zu gewinnen. Es konnte gezeigt werden, dass nach einer induzierten Regeneration der Leber unabhängig von der verwendeten Noxe eine erhöhte mRNA Expression beobachtet wurde. Dieses Ergebnis unterstreicht die generelle Bedeutung von ALR bei der Regeneration der Leber. Das vorgefundene Expressionsprofil von ALR deutet auf eine mögliche Regulation durch regenerationsassoziierte Faktoren wie z.B. Zytokine oder Wachstumsfaktoren hin. In den primären Hepatozyten als auch in Hepatomzellen war eine Induktion von ALR-mRNA und ALR Protein nach einer Stimulation mit IL-6 und eine Reduktion der ALR Expression nach Stimulation mit IL-1 beta zu sehen, jedoch nicht mit anderen Zytokinen wie TNF-alpha oder Mitogenen wie HGF und EGF. Mit Promoteranalysen, Luziferaseassays und EMSA konnte eine Beteiligung des Transkriptionsfaktors FOXA2 an der Regulation von ALR nachgewiesen werden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass IL-6 nicht nur die FOXA2 Bindung an den ALR Promoter verstärken kann, sondern auch zu einer erhöhten ALR Proteinexpression führt. Untersuchungen weiterer potentieller ALR Promoter-Bindungsstellen wie IL 6 RE und C/EBP beta ergaben keinen regulativen Einfluss auf ALR. Zusätzlich wies der ALR Promoter eine konservierte ARE Bindungsstelle für eine mögliche Bindung von Nrf2 auf was einen hepatoprotektiven Effekt von ALR nach oxidativer Stress Schädigung erklären könnte. Weitere Ergebnisse dieser Arbeit belegen, dass Zellen, die ALR überexprimieren, keinen proliferativen Vorteil in vitro oder in vivo besitzen, jedoch eine erhöhte Fähigkeit zur Adhärenz aufweisen. ALR überexprimierende Zellen zeigen eine signifikant geringere Motilität und Invasivität gegenüber Wildtyp Hepatomzellen. Ursache kann die nachgewiesene erhöhte Expression von E cadherin sein, die durch eine nachgewiesene erniedrigte Expression von SNAIL und MMP-3 verursacht sein könnte. Diese Ergebnisse sprechen für eine mögliche Umkehr der in Hepatomzellen stattgefunden epithelialen-mesenchymalen Transition (EMT) nach einer ALR Re expression. Die vorliegende Arbeit konnte die generelle Bedeutung von ALR bei der Leberregeneration unterstreichen und zeigen, dass ALR hauptsächlich durch regenerationsinitiierende Faktoren reguliert wird. Zusätzlich konnte nachgewiesen werden, dass ALR einer EMT entgegen wirken kann. Diese Ergebnisse können die Grundlage für einen zukünftigen therapeutischen Einsatz von ALR bilden.

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