| License: Publishing license for publications including print on demand (6MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-13311
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.13101
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 4 February 2010 |
| Referee: | Michael (PD Dr.) Rehli |
| Date of exam: | 1 October 2009 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmacology and Toxicology (Prof. Schlossmann, formerly Prof. Seifert) |
| Keywords: | Epigenetik , DNA , Methylierung , Gewebe , Allel , Epigenetik , DNA Methylierung , Methylierungsanalyse , Vererbung , zelltypspezifisch , allelespezifisch , DNA methylation , methylation profiling , inheritance , cell type-specific , allele-specific |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 13101 |
Abstract (English)
Epigenetic mechanisms such as histone modifications and DNA methylation extend the information of the underlying genomic DNA sequence. Understanding cell type-specific epigenetic codes on a global level is a major challenge after the sequencing of the human genome has been completed. In addition, differences in epigenetic patterns between individuals may contribute to phenotypic variation and ...
Abstract (English)
Epigenetic mechanisms such as histone modifications and DNA methylation extend the information of the underlying genomic DNA sequence. Understanding cell type-specific epigenetic codes on a global level is a major challenge after the sequencing of the human genome has been completed. In addition, differences in epigenetic patterns between individuals may contribute to phenotypic variation and disease susceptibility. However, little is known about the extent of such variation or how different epigenetic patterns are established. In the present thesis, I applied and modified the methyl-CpG immunoprecipitation (MCIp) method to globally map DNA methylation. This method is based on a recombinant, methyl-CpG-DNA binding protein (MBD2-Fc), which is used to fractionate genomic DNA depending on its methylation status.
During this thesis the MCIp-method was on the one hand modified and established for a novel application. This study was designed as a pilot project to establish the MCIp approach for comparative hypomethylation analysis. To study cell-type-specific DNA methylation differences, the MCIp procedure was used in combination with oligonucleotide promoter microarrays (MCIp-on-chip) to identify differences in promoter hypomethylation of coding and non-coding genes in human tissues. Forty-four identified tissue-specifically methylated promoters were independently validated using bisulfite sequencing or single gene MCIp, confirming the results obtained by the MCIp microarray approach. A comparison of the obtained tissue methylation profiles with corresponding gene expression data indicated a significant association between tissue-specific promoter methylation and gene expression, not only in CpG-rich promoters. The data also highlighted the exceptional epigenetic status of germ line cells in testis, where many testis-specific promoters were demethylated as compared to somatic tissues. Somatic hypermethylation particularly affected many CpG-rich promoters of testis-specific genes e.g. in ampliconic areas of the Y-chromosome.
In order to analyze individual (allele-specific) DNA methylation the MCIp-on-chip method was on the other hand further improved to the �mirror image� procedure. The �mirror image� approach was used to analyze the methylation profiles of immune cells from two inbred mice strains (C57BL/6 and BALB/c) that represent prototypic models for Th1- or Th2-dominated immune responses. Using MCIp the genomes of bone marrow-derived macrophages were fractionated into methylated and unmethylated genome pools and separately analyzed by microarray at 181 genomic regions (covering 28 Mb of mouse genome) that were selected based on differential gene expression between both mouse strains. The combined analysis of hypo- and hypermethylated profiles allowed the identification of several hundred differentially methylated regions, but also uncovered several copy number variations as well as many single nucleotide polymorphisms (SNPs) or micro- and macro-deletions/insertions. By using DNA sequencing and mass spectrometry it was shown for a subset of regions that specific allelic methylation patterns in somatic cells were maintained in F1- hybrid animals, regardless of their status in germ line cells. A common association with sequence polymorphisms suggests that the genomic context at these differentially methylated regions determines their developmentally regulated methylation in cis.
Translation of the abstract (German)
Epigenetik im Allgemeinen und DNA Methylierung im Speziellen, erweitern den Informationsgehalt der zugrundeliegenden genomischen DNA-Sequenz. Nachdem das menschliche Genom weitgehend sequenziert wurde, ist insbesondere das Verständnis von zelltypspezifischen epigenetischen Kodierungen in genomweiter Hinsicht die nächste zu bewältigende Herausforderung. Darüber hinaus sind unterschiedliche ...
Translation of the abstract (German)
Epigenetik im Allgemeinen und DNA Methylierung im Speziellen, erweitern den Informationsgehalt der zugrundeliegenden genomischen DNA-Sequenz. Nachdem das menschliche Genom weitgehend sequenziert wurde, ist insbesondere das Verständnis von zelltypspezifischen epigenetischen Kodierungen in genomweiter Hinsicht die nächste zu bewältigende Herausforderung. Darüber hinaus sind unterschiedliche epigenetische Muster auch im Verdacht, sowohl zu unterschiedlichen individuellen phänotypischen Ausprägungen, als auch zu der individuellen Anfälligkeit für bestimmte Krankheiten beizutragen. Allerdings ist über das Ausmaß solcher Unterschiede und deren Etablierung sehr wenig bekannt. In dieser Arbeit wurde die Methyl-CpG Immunpräzipitations (MCIp)-Methode verwendet, um die DNA Methylierung unter zwei Aspekten zu untersuchen. Die Methode basiert auf einem rekombinanten, methyl-CpG-DNA bindenden Protein (MBD2-Fc), mit dessen Hilfe genomische DNA hinsichtlich ihres Methylierungsgrades fraktioniert werden kann.
Zunächst wurde die MCIp Methode während dieser Arbeit modifiziert und für eine neue Anwendung etabliert. Diese Studie war als Pilotprojekt angelegt um die Verwendung der MCIp Methode zur vergleichenden Analyse der DNA Hypomethylierung zu etablieren. Um zelltypspezifische DNA Methylierungsunterschiede untersuchen zu können, wurde die MCIp Methode mit Promotor Microarrays kombiniert, um gewebespezifische Unterschiede in der Hypomethylierung von Promotoren codierender und nicht codierender Gene zu analysieren. Daraufhin wurden 44 als gewebespezifisch methyliert identifizierte Promotoren mit Microarray-unabhängigen Methoden validiert. Hierzu wurde sowohl die MCIp-Methode zum Nachweis der Methylierung an Einzelgenen als auch die Sequenzierung von Natriumbisulfit-behandelter genomischer DNA angewendet. Nach Validierung der Arrayergebnisse wurden die resultierenden gewebsspezifischen Methylierungsmuster mit der Expression der entsprechenden Gene verglichen. Es stellte sich heraus, dass nicht nur in stark CpG-haltigen Promotoren die gewebespezifische Methylierung und die Expression signifikant miteinander korrelierten. Sondern auch, dass Keimbahnzellen aus dem Hodengewebe, ein im Vergleich zu somatischen Zellen, außergewöhnliches epigenetisches Muster aufwiesen. So waren im Besonderen, stark CpG-haltige Promotoren hodenspezifischer Gene von somatischer Hypermethylierung betroffen. Diese Gene waren vor allem in ampliconischen Bereichen des Y-Chromosoms zu finden. Die kombinierte Anwendung von MCIp, zur Probenvorbehandlung, und Microarrays, als globales Auslesesystem, ermöglichten in diesem Projekt die unverfälschte und unvoreingenommene Analyse gewebespezifischer Promotormethylierung.
Um individuelle (allele-spezifische) DNA Methylierungsunteschiede untersuchen zu können, wurde die MCIp-on-chip zur �mirror image� Anwendung weiterentwickelt. Damit wurden in einem zweiten Projekt Immunzellen zweier Maus-Inzuchtstämme (C57BL/6 und BALB/c), die ein prototypisches Model für die Th1- oder Th2-dominierte Immunantwort darstellen, analysiert. Hierbei wurde die MCIp-Methode verwendet, um die Genome von murinen Knochenmarksmakrophagen in einen methylierten und einen unmethylierten Teil aufzutrennen. Die jeweiligen korrespondierenden DNA-Pools beider Mausstämme wurden auf einen spezifisch hergestellten Microarray hybridisiert. Da epigenetische Unterschiede vermehrt in Bereichen differentieller Genexpression zwischen Knochenmarks-makrophagen beider Mausstämme zu erwarten sind, wurden zunächst 181 dieser Regionen ausgewählt und für das Arraydesign herangezogen. Insgesamt wurden damit 28 Mb des murinen Genoms abgedeckt. Die kombinierte Analyse der hypo- und hypermethylierten Teilbereiche ermöglichte die Identifizierung von mehreren hundert unterschiedlich methylierten Regionen. Ferner wurden auch verstärkt genetische Variationen, wie Unterschiede in der Genkopiezahl, Insertionen und Deletionen im Mikro- und Makromaßstab, sowie Einzelnukleotid-Polymorphismen zwischen beiden Mausstämmen festgestellt. Anschließend wurde eine ausgewählte Anzahl von Regionen mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie und Sequenzierung von Natriumbisulfit-behandelter DNA eingehender untersucht. Dabei zeigte sich, dass die Methylierungsmuster elterlicher Allele im Wesentlichen auch in F1-Tieren, unabhängig vom Methylierungsgrad dieser Regionen in Keimbahnzellen, beibehalten wurden. Dieses Phänomen war häufig mit Sequenz-unterschieden zwischen den Allelen assoziiert. Dies führte zu der Annahme, dass die entwicklungsspezifische Methylierung dieser Regionen maßgeblich durch die lokale genetische Sequenz in cis reguliert wird.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 10:15
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