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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-131040
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Number of Pages: | 148 |
| Date: | 21 July 2010 |
| Referee: | Prof. Dr. Ralph Witzgall and Prof. Dr. Richard Warth |
| Date of exam: | 5 February 2010 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Anatomie > Lehrstuhl für Molekulare und zelluläre Anatomie > Prof. Dr. Ralph Witzgall |
| Interdisciplinary Subject Network: | Not selected |
| Keywords: | Nagel-Patella-Syndrom, LIM-Homöodomäne-Transkriptionsfaktor 1 Beta, Nuklearfaktor Kappa B, Transkription, RT-qPCR-Analysen, Dual-Luciferase Assay, HeLa-Zelle, Transkriptionsfaktor, Genregulation, RNA-Interferenz |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 13104 |
Abstract (German)
Der LIM-Homöodomäne-Transkriptionsfaktor LMX1B spielt eine wichtige Rolle sowohl bei der Entwicklung als auch bei der Aufrechterhaltung von zahlreichen Geweben. So führen Mutationen im LMX1B-Gen zum Erscheinungsbild des Nagel-Patella-Syndroms, einer autosomal dominant vererbten Erkrankung, zu dessen typischen Charakteristika unter anderem fehlgebildete Fingernägel, fehlende Patellen sowie eine ...
Abstract (German)
Der LIM-Homöodomäne-Transkriptionsfaktor LMX1B spielt eine wichtige Rolle sowohl bei der Entwicklung als auch bei der Aufrechterhaltung von zahlreichen Geweben. So führen Mutationen im LMX1B-Gen zum Erscheinungsbild des Nagel-Patella-Syndroms, einer autosomal dominant vererbten Erkrankung, zu dessen typischen Charakteristika unter anderem fehlgebildete Fingernägel, fehlende Patellen sowie eine Nephropathie zählen. LMX1B-Knockout-Maus Studien konnten zwar mutmaßliche Zielgene von LMX1B identifizieren, jedoch ohne eine molekulare Charakterisierung bleibt es fraglich, ob es sich hierbei in der Tat um direkte Zielgene von LMX1B handelt. Bis zum heutigen Zeitpunkt ist wenig über den Mechanismus der Transkriptionsaktivierung von LMX1B sowie über die Signalwege, die LMX1B reguliert, bekannt. Am Lehrstuhl von Prof. Dr. Ralph Witzgall wurde erstmals gezeigt, dass LMX1B die Geninduktion von bestimmten NF-kB-Zielgenen wie z.B. IL6 oder IL8 in HeLa-Zellen aktiviert.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die molekulare Wirkungsweise von LMX1B bei der Regulierung dieser NF-kB-Zielgene näher zu charakterisieren. Dafür wurde hauptsächlich ein spezielles zelluläres Expressionssystem verwendet, welches eine regulierbare Synthese von LMX1B unter Anwendung des Tet-off-Systems in HeLa-Zellen ermöglicht. Mit diesen LMX1B-produzierenden HeLa-Zellen wurden zunächst Lokalisationsstudien durchgeführt, um zu untersuchen, ob LMX1B möglicherweise indirekt im Zytosol regulierend auf die NF-kB Aktivität eingreift. Nachdem festgestellt wurde, dass LMX1B die Translokation von NF-kB in den Zellkern nicht erhöht, war von einer Aktivierung der Geninduktion auf nukleärer Ebene auszugehen. Dass NF-kB direkt daran beteiligt ist, konnten siRNA-Experimente demonstrieren, bei der spezifisch eine Untereinheit von NF-kB gehemmt wurde. Dieser Befund, zusammen mit weiteren Daten der Arbeitsgruppe zeigten schließlich, dass LMX1B und NF-kB nach jeweiliger Bindung an DNA funktionell kooperieren.
Um die molekularen Mechanismen, durch welche LMX1B und NF-kB die Transkription von NF-kB-Zielgenen aktivieren, näher charakterisieren zu können, wurden Luciferase Reportergen-Assays durchgeführt, wobei IL6 als exemplarisches NF-kB-Zielgen verwendet wurde. So konnte zum ersten Mal an einem nativen Promotor gezeigt werden, dass LMX1B die Transkription eines NF-kB-Zielgens durch Bindung an das sogenannte FLAT-Element, welches bereits anderweitig als LMX1B-Bindungsmotiv vermutet wurde, aktivieren kann. Diese Assays führten zugleich zu der Annahme, dass ein gemeinsamer Kofaktor an der Transaktivierung beteiligt ist. Durch die Verwendung verschiedener LMX1B-Mutanten, die ebenfalls in Reportergen-Assays auf ihre Fähigkeit zur Transkriptionsaktivierung des IL6 Promotors getestet wurden, stellte sich heraus, dass sowohl die DNA-bindende Homöodomäne als auch die LIM-Domänen, im speziellen die LIM2-Domäne, von LMX1B hierbei essentiell sind. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit schließlich ein Modell der Regulierung von NF-kB-Zielgenen durch LMX1B in HeLa-Zellen aufgestellt werden. Bei diesem Modell kooperieren LMX1B und NF-kB auf Chromatinebene bei der Transaktivierung der NF-kB-Zielgene, wobei für eine maximale Transkriptionsaktivierung beide Transkriptionsfaktoren sehr wahrscheinlich einen gemeinsamen Kofaktor benötigen, den es jedoch noch zu identifizieren gilt.
Somit konnte mit denen aus dieser Arbeit und den von der Arbeitsgruppe gewonnen Daten, die mittlerweile veröffentlicht wurden, erstmalig für LMX1B eine direkte Beteiligung an der Regulierung der Expression von NF-kB-Zielgenen in HeLa-Zellen demonstriert werden. Des Weiteren wurde die wichtige Erkenntnis gewonnen, dass eine funktionelle Interaktion zwischen dem LMX1B-Signalweg und dem NF-kB-Signalweg existiert. Jetzt kann in zukünftigen, auf dieser Arbeit aufbauenden Forschungen der Zusammenhang zwischen den hier gewonnenen Daten über LMX1B im HeLa-Zellsystem und dem Nagel-Patella-Syndrom beim Menschen gezeigt werden. Möglicherweise lassen sich diese neuen Einsichten über die molekulare Wirkungsweise von LMX1B zusammen mit NF-kB auch auf den Menschen übertragen.
Translation of the abstract (English)
LMX1B is a LIM-homeodomain transcription factor involved in the development and function of the limb, eye, brain and kidney. Heterozygous mutations in LMX1B are responsible for nail-patella syndrome (NPS), a rare autosomal dominant disorder characterized by skeletal dysplasia, neurological abnormalities and podocyte-associated nephropathy. Mouse gene targeting studies identified putative LMX1B ...
Translation of the abstract (English)
LMX1B is a LIM-homeodomain transcription factor involved in the development and function of the limb, eye, brain and kidney. Heterozygous mutations in LMX1B are responsible for nail-patella syndrome (NPS), a rare autosomal dominant disorder characterized by skeletal dysplasia, neurological abnormalities and podocyte-associated nephropathy. Mouse gene targeting studies identified putative LMX1B target genes. However, in the absence of in vivo molecular characterization of their regulation, their identity as direct LMX1B targets remains hypothetical and transcriptional regulation by LMX1B remains poorly understood. The institute of Prof. Dr. Ralph Witzgall has shown for the very first time that expression of LMX1B leads to the induction of a subset of NF-kB target genes, such as IL6 or IL8 in HeLa cells.
The aim of this work was to better characterize the molecular mechanism of transcriptional regulation of those NF-kB target genes by LMX1B.
Therefore a cellular experimental system was mainly used, that allows an inducible LMX1B expression in HeLa cells. Localization studies with those LMX1B-expressing cells were first performed to determine whether LMX1B is acting directly at the nuclear level or indirectly for instance by affecting a component of the cytosolic NF-kB pathway. The observation that LMX1B does not influence nuclear translocation of NF-kB argues against an indirect activation of the upstream NF-kB pathway by LMX1B and rather suggests a regulation at the nuclear level. siRNA-experiments, were expression of the p65 subunit of NF-kB was knocked down, showed that NF-kB itself is involved in the regulation of NF-kB target genes by LMX1B. This result, together with other data of the group, demonstrated finally that LMX1B and NF-kB functionally cooperate, after binding to DNA.
To better characterize the molecular mechanism how LMX1B and NF-kB activate transcription of NF-kB target genes, luciferase reporter assays were performed, using the NF-kB target gene IL6. These functional analyses demonstrated for the first time that LMX1B can activate transcription from the native IL6-promoter and that this is mainly mediated by so called FLAT element, which has been already described as putative LMX1B binding motif. The assays also suggest that functional cooperation between LMX1B and NF-kB might involve the recruitment of a common cofactor. The use of different LMX1B mutants, also tested in the reporter assays for their ability to activate transcription from the IL6-promoter, revealed that the DNA binding homeodomain as well as the LIM domains, especially the LIM2 domain, are essential for LMX1B transcriptional activation. Altogether the data of this work lead to a model of regulation of NF-kB target genes by LMX1B, in which both transcription factors functionally cooperate at the chromatin level. In doing so, it is very likely that LMX1B und NF-kB require for a maximal transcriptional activation a common cofactor, which still has to be identified.
These results provide novel molecular insights into LMX1B transcriptional activity and may contribute to a better understanding of NPS pathology.
Metadata last modified: 03 Jun 2018 19:03
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