| License: Publishing license for publications excluding print on demand (3MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-133515
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.13351
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Place of Publication: | 01.08.2010 |
| Number of Pages: | 225 |
| Date: | 4 August 2010 |
| Referee: | Prof. Dr. Hans-Achim Wagenknecht and Prof. Dr. Burkhard König |
| Date of exam: | 26 March 2010 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institut für Organische Chemie > Alumni or Retired Professors > Arbeitskreis Prof. Dr. Hans-Achim Wagenknecht |
| Interdisciplinary Subject Network: | Not selected |
| Keywords: | Cyaninfarbstoff, fluoreszente H-Aggregate, DNA, RNA, Molecular Beacon, Klick-Chemie, azyklischer Linker |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 13351 |
Abstract (German)
Der asymmetrische Cyaninfarbstoff Thiazol Orange konnte über das azyklische Linkersystem (S)-3-Amino-1,2-propandiol als Basensurrogat in DNA eingebaut werden. Bei Duplexen, die den Chromophor als Monomer bergen, ist eine grüne Fluoreszenzfarbe mit einem Maximum bei 530 nm und der TO-typischen Feinstruktur zu beobachten. Wird das Thiazol Orange als diagonales Basenpaar in DNA eingebaut, ändern ...
Abstract (German)
Der asymmetrische Cyaninfarbstoff Thiazol Orange konnte über das azyklische Linkersystem (S)-3-Amino-1,2-propandiol als Basensurrogat in DNA eingebaut werden. Bei Duplexen, die den Chromophor als Monomer bergen, ist eine grüne Fluoreszenzfarbe mit einem Maximum bei 530 nm und der TO-typischen Feinstruktur zu beobachten. Wird das Thiazol Orange als diagonales Basenpaar in DNA eingebaut, ändern sich die optischen Eigenschaften drastisch. Im Absorptionsspektrum sind excitonische, hypsochrom verschobene Banden zu sehen, wie sie typischerweise bei H-Aggregaten zu beobachten sind. Die excitonischen Wechselwirkungen führen auch im CD-Spektrum zu einem deutlichen Signal bei 510 nm. Im Emissionspektrum ist jedoch keine Fluoreszenzlöschung zu sehen, wie es für H-Aggregate zu erwarten gewesen wäre, sondern es ist eine bathochrom verschobene, strukturlose Emissionsbande zu beobachten, die mit einem Maximum bei 585 nm eine orangefarbene Emission aufweist. Dieses Phänomen ist nach sorgfältiger Literaturrecherche seither unbekannt. Es konnte eine deutliche Stabilisierung des Duplexes durch das TO-Dimer beobachtet werden, so wie eine längere Fluoreszenzlebenszeit im Vergleich zum TO-Monomer. Durch thermische Dehybridisierungsstudien konnte gezeigt werden, dass für die Dimerbildung ein rigides Gerüst notwendig ist, wie es durch die DNA-Doppelhelix gewährleistet wird. Die sorgfältige Evaluation der Sensitivität des TO-Dimers auf unterschiedliche Nachbar- und Gegenbasen hat gezeigt, dass das Dimer universell in Oligonukleotide einsetzbar ist. Es wurden kleine, zu vernachlässigende Intensitätsunterschiede in Abhängigkeit der Nachbar- und Gegenbasen festgestellt, es ist jedoch in allen Fällen eine dimere Emissionsbande bei 585 nm festzustellen.
Im Gegensatz dazu konnte beim Einbau der beiden Chromophore in denselben DNA Strang nur eine Emissionslöschung festgestellt werden. Bei antiparalleler Anordnung der Chromophore, im Gegensatz zur parallelen Anordnung, ist ein Maximum bei ungefähr 560 nm zu beobachten, das für eine schwache, gelbe Emissionsfarbe der DNA-Lösungen sorgt. Die schwachen Intensitäten der CD-Signale deuten darauf hin, dass es bei einer (anti-)parallelen Anordnung der Chromophore im selben DNA Strang zu keiner Verdrehung der Übergangsdipolmomente der Farbstoffe kommt. Dadurch ist der Übergang in den eigentlich verbotenen, niedrigeren Exciton-Zustand nicht möglich und die Fluoreszenz der Chromophore wird gelöscht.
Durch die zeitaufgelösten, transienten Absorptionsmessungen der Arbeitsgruppe Fiebig konnte gezeigt werden, dass das TO-Dimer bereits aggregiert vorliegt, wenn es durch den pump-Puls angeregt wird. Dadurch ist bewiesen, dass es sich beim Thiazol-Orange-Dimer nicht um Excimere handelt. Unterstützt durch die charakteristischen Absorptions-, Emissions- und CD-Spektren und den Resultaten von Würthner und Wortmann 2006, liegt die Vermutung nahe, dass es sich bei den Thiazol-Orange-Dimeren um fluoreszente H-Aggregate handelt. In der Literatur sind seither nur H-Aggregate bekannt, die keine Emission aufweisen und wenn doch, dann nur unter speziellen Bedingungen, wie zum Beispiel der Einbettung in Langmuir-Blodgett-Schichten oder in gefrorenen Lösungen. Fluoreszente H Aggregate in DNA sind unseres Wissens nach unbekannt, Thiazol Orange ist hierfür ein einzigartiges Beispiel.
Um die typischen optischen Eigenschaften des TO-Dimers im Vergleich zum TO-Monomer für analytische Zwecke auszunutzen, wurden beide Chromophore in den Stamm einer Haarnadel eingebaut. In geschlossenem Zustand aggregieren die Farbstoffe, wodurch die Haarnadel eine orangefarbene Emission aufweist, wie sie für das TO-Dimer typisch ist. Während der Titration mit dem komplementären Gegenstrang ändert sich die Emissionsfarbe über gelb nach grün. Durch die Zugabe des komplementären Zielstranges öffnet sich die Haarnadel und beide Chromophore werden voneinander separiert, es zeigen sich dadurch die optischen Eigenschaften des TO-Monomers. Dieser Vorgang lässt sich mit bloßem Auge verfolgen. Werden Gegenstränge zur Haarnadel zugegeben, mit denen es zu einer Basenfehlpaarung im entstehenden Duplex kommen würde, öffnet sich die Haarnadel nicht. Die Emissionsfarbe der DNA-Lösungen wird ein wenig heller und erscheint gelb, ist aber deutlich von der grünen Farbe der geöffneten Haarnadel zu unterscheiden. Es konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass mit dem Thiazol-Orange-Dimer eine SNP-Detektion möglich ist, die ohne aufwändige Geräte durchgeführt werden kann. Es kann schlicht anhand der Emissionsfarbe der DNA-Lösungen erkannt werden, ob eine Basenfehlpaarung vorliegt oder nicht.
Die ausführliche Evaluation der Stammlänge der mit Thiazol Orange modifizierten Haarnadeln hat gezeigt, dass mindestens eine Länge von acht Basenpaaren notwendig ist, um das TO-Dimer mit der Molecular-Beacon-Technik analytisch nutzen zu können.
Das Konzept der dualen Markierung von DNA mit Thiazol Orange lässt sich auf RNA übertragen. Das TO-Dimer zeigt im Gegensatz zum TO-Monomer auch in einem RNA Duplex deutlich veränderte optische Eigenschaften, wie sie in DNA beobachtet werden konnte. Es sind kleine, jedoch zu vernachlässigende Unterschiede festzustellen, die vermutlich aus der unterschiedlichen Struktur der A-RNA-Helix im Vergleich zu einer B-DNA-Helix resultieren. Werden mit Thiazol Orange modifizierten RNA Duplexe in CHO-K1-Zellen mikroinjiziert, ist eine Unterscheidung der monomeren und dimeren Emission unter dem Fluoreszenzmikroskop möglich. Es konnte eine Stilllegung des für EGFP codierenden Gens in CHO-K1/EGFP-Zellen mit siRNA erreicht werden, die mit monomerem Thiazol Orange markiert war. Trotz der Größe des Chromophors konnte eine reduzierte Expression des EGFPs auf knapp 20 % erreicht werden. Durch die duale Markierung von RNA mit Thiazol Orange wird die fluoreszente Bandbreite der Zellanalytik erweitert und eröffnet neue Perspektiven in der Grundlagenforschung.
Für die Bioanalytik von Nukleinsäuren werden möglichst helle Fluoreszenzsonden verwendet. Die Phosphoramiditstrategie automatisierter DNA-Synthese ermöglicht den Einbau einer Vielzahl organischer Fluorophore in Oligonukleotide an spezifischen Stellen der Sequenz. Das Potential dieser Methode wird jedoch stark eingeschränkt, wenn Chromophore den harschen Bedingungen der stark sauren, basischen und oxidativen DNA-Synthese und -Aufarbeitung nicht standhalten und durch diese zerstört werden. Eine Alternative hierzu bietet die sogenannte Klick-Chemie, genauer die kupferkatalysierte Acetylen Azid Cycloaddition, mit der eine postsynthetische Ligation solcher Chromophore möglich ist. Ein repräsentativer Vertreter basenlabiler Chromophore ist Nilblau, der mit guten Quantenausbeuten und sehr gutem Interkalationsverhalten für die Nukleinsäureanalytik von großem Interesse wäre.
Ziel war es, das in der Arbeitsgruppe Wagenknecht standardmäßig verwendete Linkersystem basierend auf (S)-3-Amino-1,2-propandiol für die Klick-Chemie weiterzuentwickeln. So sollte das Linkersystem um eine Acetylenfunktion erweitert werden, um ein Nilblau-Azid als repräsentativer, basenlabiler Chromophor an den bereits synthetisierten DNA-Strang anzufügen. Nilblau besitzt ein geeignetes Redoxpotential, um im angeregten Zustand Guanin in unmittelbarer Umgebung zu oxidieren, wodurch die Fluoreszenz gelöscht wird. Diese Eigenschaft sollte ausgenutzt werden, um weitere Untersuchung durchzuführen. So sollte der Einfluss der Chiralität des Linkers auf die optischen Eigenschaften des Chromophors untersucht werden. Zusätzlich sollte der Einfluss eines glykosidischen Anknüpfungssystem auf die optischen Eigenschaften des Chromophors im Vergleich zum azyklischen Klick-Linkersystem untersucht werden. Dazu wurde in der Arbeitsgruppe ein Uridin an der 2’-Position mit einem Acetylen modifiziert und für die Vergleichsexperimente zur Verfügung gestellt.
Die Synthesen des azyklischen (R)-Linkers konnten analog zu den Synthesen des (S) Linkers durchgeführt werden. Anstatt des (S)-Amino-1,2-propandiols wurde das (R)-Amino-1,2-propandiol-Enantiomer für die Synthesen verwendet. Die Weiterentwicklung zu den entsprechenden Klick-Linkern konnte sehr einfach durch die carbamatvermittelte Kopplung der Aminfunktion der Linker mit einem Propargylalkohol erreicht werden. Der Einbau der Linkersysteme in verschiedene Oligonukleotide erfolgte über die Standardphosphoramiditstrategie.
Durch die CuAAC gelang die postsynthetische Ligation von Nilblau an bereits synthetisierten, mit Acetylen modifizierten Oligonukleotiden.
Die unterschiedliche Chiralität der Klick-Linker hat nur einen kleinen und zu vernachlässigenden Einfluss auf die Duplexstabilität und die optischen Eigenschaften des Chromophors Nilblau. Die Schmelztemperatur der Duplexe, die UV/VIS Absorptionsspektren und die Emissionsprofile zeigen deutlich, dass der Chromophor sehr gut in die Doppelhelix interkaliert, ungeachtet der Chiralität der verwendeten Linker. Dies konnte durch geometrisch optimierte Modelldarstellungen der Duplexe veranschaulicht werden. Tatsächlich ist es für die optischen Eigenschaften des Nilblau-Fluorophors und für die Schmelztemperatur der Duplexe unerheblich, ob der (R)- oder (S)-Linker verwendet wird.
Erstaunlicherweise sind die optischen Eigenschaften des Nilblau-Chromophors ebenfalls unabhängig von der Art der Anknüpfung an das Oligonukleotid. Es ist für die optischen Eigenschaften unerheblich, ob der Chromophor über die 2’-Position eines Uridins oder über das azyklische (S)-Linkersystem an die DNA gebunden wird. Das Klick-Uridin erkennt jedoch Adenin als Gegenbase und kann daher bevorzugt als Ligationsmodifikation verwendet werden, wenn Duplexstabilität und Sequenzerkennung eine wichtige Rolle spielen.
Translation of the abstract (English)
We demonstrate how to use DNA as a scaffold for the assembly of a pair of a cyanine chromophore, thiazole orange (TO), which makes the hybridization and dehybridization visible for naked eyes. TO as an artificial DNA base represents a bright fluorescent probe. The DNA architecture around two TO dyes that have been incorporated as single artificial bases into two complementary oligonucleotides ...
Translation of the abstract (English)
We demonstrate how to use DNA as a scaffold for the assembly of a pair of a cyanine chromophore, thiazole orange (TO), which makes the hybridization and dehybridization visible for naked eyes. TO as an artificial DNA base represents a bright fluorescent probe. The DNA architecture around two TO dyes that have been incorporated as single artificial bases into two complementary oligonucleotides yields a TO dimer that shows altered optical properties inside the duplex. The monomeric TO dye shows the typical green emission (~530 nm) whereas the TO dimer exhibits an orange excimer-type emission (~580 nm) with a Stoke’s shift of ~ 100 nm. The necessity of a tight framework deriving from the DNA duplex can be shown by the control of temperature. The emission colour changes from orange to green at higher temperatures and vice versa at lower temperatures. The thermal dehybridization of the TO dimer is observable in the absorption spectra at 507 nm and occurs at a very similar temperature as the cooperative dehybridization of the whole duplex, normally discernible at 260 nm (hyperchromic effect).
The universal applicability of the TO dimer could be shown by exchanging step-by-step the neighbour and counter bases. In any case, the emission maximum change from 530 nm (monomer) to 580 nm (dimer) occurs, with little alterations in fluorescence intensity. Transient absorption measurements revealed that the TO-dimer is not an excimer but, according to it the results of Würthner and Wortmann in 2006, could be regarded as fluorescent H-aggregates.
As a first application, we incorporated the TO dimer into the stem of a molecular beacon, yielding the characteristic orange-coloured excimer-type emission. During the titration with the unmodified counter strand the hairpin opens, the emission colour changes from orange to yellow. With addition of 4.9 eq. of the fully matched counter strand, the emission shift is complete, the hairpin is open and visualized by the characteristic green fluorescence of the monomers. To investigate how sensitive this fluorescence system is, we titrated the molecular beacon with target strands that contained only one mismatch, positioned in the middle of the strand. Interestingly, none of these targets were able to open the loop, hence, orange emission retained. Thus, a molecular issue, the existence of just one mismatched base pair, could be made observable by ones bare eyes, there is no necessity of cost intensive detection machinery. To reveal the different emission properties of both chromophore states, we built the ratio of the green and orange fluorescence intensity maxima. Assigned against the equivalents of each titration step, the prior empirical finding of the loops not to be opened by the mismatched targets, becomes very clear in the different slopes of the graphics.
The development of efficient and medically useful siRNA and the arising desire for new fluorophore labeling possibilities and analytic methods in cells, begs the question, if the TO dimer works as well in RNA as in DNA and can be used therefore as a new tool in RNA and chemical cell analytics. Due to the altered shape of a RNA duplex (A-helix) compared to a DNA duplex (B-helix), in particularly concerning the wide and shallow minor groove, the TO dimer showed little differences in its optical properties. The shift from the monomer maximum (530 nm) to the dimer maximum is not as large as in DNA (574 nm instead of 585 nm). Actually, this 11 nm difference can be detected by bare eyes, the excited solution is yellow coloured, not orange. Anyway, the TO dimer with its special optical properties is formed with little alterations as well in RNA as in DNA.
As a consequential step, the verification ensued, that the green colour of the monomer and the yellow/orange colour of the dimer is visible in cells that were incubated or microinjected with corresponding oligonucleotides under a fluorescence microscope. Furthermore, we were able to reduce expression of EGFP in CHO-K1/EGFP cells with single labelled oligonucleotides. Thus, the TO dimer in nucleic acids has a significant potential for the application in molecular diagnostics, such as molecular beacons and on microarrays. Moreover, the TO dimer can be used as an optical hybridization probe for investigations in chemical cell biology that are followed by fluorescence microscopy, such as gene or RNAi delivery to cells.
Bioanalytical methods based on nucleic acids often require the use of bright DNA labels for fluorescence readout. The standard phosphoramidite DNA building block strategy enables a large variety of organic fluorophores to be routinely incorporated at specific positions within the oligonucleotide. In recent years, the “click” ligation strategy has become an important alternative. Huisgen originally described the [2+3]-cycloaddition between alkynes and azides yielding 1,2,3-triazoles with high regioselectivity by adding Cu(I). The utility of this reaction as a bioligation method has grown incredibly due to the mild reaction conditions and the bioorthogonal functional groups meaning that both alkynes and azides typically are not present in biopolymers. It became clear that “click” chemistry is predestined for the application as a postsynthetic ligation for nucleic acids in order to avoid the time-consuming synthesis of phosphoramidites as DNA building blocks. This is especially important for a number of remarkable and brightly emitting fluorophores, such as phenoxazinium dye Nile Blue that is not compatible with the acidic, oxidative or basic conditions of automated DNA phosphoramidite chemistry and DNA workup. We demonstrate the incorporation of this dye using the postsynthetic click chemistry. A range of DNA duplexes was modified with the phenoxazinium azide; one set of duplexes carried the chromophore attached at the 2’-position of uridine, and a second set contained the chromophore as a non-nucleosidic DNA base surrogate that has been inserted using an acyclic glycol linker. These phenoxazinium-modified duplexes were characterized by optical spectroscopy. Remarkably, the fluorescence properties do not depend on the modification site. It does not matter whether the chromophore has been attached to the 2′-position of uridine or as DNA base surrogate using the acyclic glycol linker. Furthermore, the chirality of the linker system does not effect the optical properties of the attached chromophore. The 2’-chromophore-modified uridine still recognizes adenine as the counterbase and the duplexes do not exhibit a reduced thermal stability in comparison to the unmodified duplexes.
The postsynthetic “click” chemistry allows the incorporation of this bright but base labile chromophore and makes it now accessible to fluorescent oligonucleotide analytics.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 10:03
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