| Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen mit Print on Demand (80MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-134111
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.13411
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 21 April 2010 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Manfred Sumper |
| Tag der Prüfung: | 29 Mai 2009 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Entpflichtet bzw. im Ruhestand > Prof. Dr. Manfred Sumper |
| Stichwörter / Keywords: | Biomineralisation, Dictyostelium discoideum, Molluskenschale, organische Matrix, Myosin-Chitinsynthase, rekombinante Myosindomäne, biomineralization, dictyostelium discoideum, myosin-chitinsynthase, recombinant myosin domain, organic matrix, mollusc shell |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 13411 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Chitin spielt möglicherweise eine funktionelle Rolle bei der Schalenentwicklung von Mollusken. Man vermutet, dass an der Grenzfläche zwischen den Mantelepithelzellen und der mineralisierenden Schale physikalische Kräfte auftreten. Es stellt sich die Frage, ob eine transmembrane Myosin-Chitinsynthase kolloidale Scherkräfte zwischen der wachsenden Schale und dem Cytoskelett der Mantelepithelzellen ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Chitin spielt möglicherweise eine funktionelle Rolle bei der Schalenentwicklung von Mollusken. Man vermutet, dass an der Grenzfläche zwischen den Mantelepithelzellen und der mineralisierenden Schale physikalische Kräfte auftreten. Es stellt sich die Frage, ob eine transmembrane Myosin-Chitinsynthase kolloidale Scherkräfte zwischen der wachsenden Schale und dem Cytoskelett der Mantelepithelzellen detektieren und ausgleichen kann, und damit die Assemblierung des Chitins und indirekt die Kristallisation von amorphen Calciumcarbonat beeinflusst werden könnte.
Derzeit ist noch nicht geklärt, wie die hoch konservierten Myosin-Chitinsynthasen der Mollusken bezüglich der Familien der Myosine und der Glykosyltransferasen zu klassifizieren sind. Die Myosindomänen der Chitinsynthasen der Mollusken sind phylogenetisch von den bisher bekannten Myosinklassen getrennt. Die komplexe Transmembranarchitektur der Chitinsynthasen von Mollusken und Insekten wurde selbst bei Pilzen noch nicht beschrieben. Eine detaillierte Charakterisierung der Myosin-Chitinsynthasen von Mollusken am Beispiel der Ar-CS1 ist also eine wichtige Voraussetzung, um die Bildung von komplexen mineralisierten Strukturen, die auf Chitin basieren, wie z.B. Perlmutt verstehen zu können.
In dieser Arbeit werden die ersten molekularen und biochemischen Studien der Myosindomäne der Ar-CS1 vorgestellt. Da die Übergangsregion niedriger Komplexität ionisch wechselwirken könnte, wurde die Myosindomäne der Ar-CS1 mit und ohne diese Region kloniert. Für die Untersuchung der Funktion einer mutmaßlichen Regulationsstelle wurde die Myosindomäne der Ar-CS1 auch durch ortsspezifische Mutationen verändert. Dictyostelium discoideum zeigte sich als geeignetes Expressionssystem. Die Verteilung der Myosindomänen der Ar-CS1 innerhalb der D. discoideum-Zellen wurde mittels Immunfluoreszenztechniken untersucht. Alle Varianten der Myosindomänen der Ar-CS1 waren im Cytoplasma lokalisiert. Standardreinigungsprotokolle für Myosine waren im Falle der Myosindomäne der Ar-CS1 nicht erfolgreich. Prinzipiell gelten die aus dem Cytoskelett extrahierten Myosindomänen als funktionell. Es zeigte sich, dass die Myosindomäne nur in Gegenwart von Harnstoff oder Kaliumiodid, die vermutlich auf hydrophobe Wechselwirkungen wirken, gelöst werden konnten. Folgendes Protokoll hat sich zur Aufreinigung rekombinanter Myosindomänen der Ar-CS1 bewährt: Zellen werden ohne Detergenz lysiert und mittels Ultrazentrifugation fraktioniert. Der lösliche Extrakt wurde gegen einen Puffer mit KI dialysiert und einer Ni-NTA-Chromatographie unterzogen. Ein 90 kDa Protein, das im Eluat Hauptbestandteil war, wurde mittels MALDI als Myosindomäne der Ar-CS1 identifiziert. Diese Arbeit mit der präparativen Isolierung der Myosindomänen legt den Grundstein für weitere biochemische und biophysikalische Untersuchungen der regulatorischen Funktionen und der Prozessivität und der Kraftentfaltung dieses molekularen Motors.
Zweites Ziel dieser Arbeit war die Etablierung von D. discoideum-Zelllinien für die Untersuchung der von Ar-CS1 katalysierten Chitinsynthese in vivo ähnlich zu den Bedingungen in den Mantelepithelzellen. Bisher wurde in der Literatur noch nicht die heterologe Expression eines komplexen Membranproteins wie der Ar-CS1 beschrieben. Ar-CS1 mit einem Fluoreszenztag wurde in Ax3 orf+ sowie in Cellulossynthase defiziente dcsA- transformiert. In ersten Analysen wiesen die Ar-CS1 exprimierenden Zelllinien reproduzierbar Fluoreszenzsignale in zwei verschiedenen Mustern auf: über das gesamte Cytoplasma verteilt oder in globulären Strukturen akkumuliert. Ar-CS1-YFP kommt auch im Zellcortex und in Filopodien vor. Basierend auf diesen Beobachtungen kann man eine direkte Wechselwirkung mit den Aktincytoskelett annehmen. Zudem wurde Ar-CS1-YFP in Plasmamembranfraktionen nachgewiesen. Aktivität wurde in vitro in radioaktiv markierten Chitinpolymeren untersucht. Zudem wurden schwache Signale an der Oberfläche von in Gegenwart von UDP-GlcNAc kultivierten Zelllinien und in deren filtrierten Kulturüberstand mittels Calcofluor White und mit GFP-getaggten Chitinbindeproteinen detektiert. Dies deutet auf die Fähigkeit der Zelllinien, prinzipiell Chitinfragmente zu bilden, die vorwiegend in das Medium abgegeben werden, hin. AFM Studien der Oberfläche von Ar-CS1-YFP exprimierenden Zellen zeigte eine körnige Feinstruktur, die auf Wildtypzellen nicht beobachtet werden konnte.
Insgesamt ist D. discoideum vermutlich für eine funktionelle Expression der Ar-CS1 geeignet. Gegenstand weiterer Studien bleibt, wie die Rate der Chitinsynthese reguliert wird und ob die Myosindomäne eher für die Ausbildung oder Detektion der Kräfte als für den Transport wie andere unkonventionelle Myosine dient. Die neuen Zelllinien, die in dieser Arbeit hergestellt wurden, sind ein vielversprechendes Modellsystem, um enzymatische Einblicke in chitin-abhängige Biomineralisationsprozesse zu gewinnen.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Chitin has been suggested to fulfil a functional role in mollusc shell formation. According to current hypotheses, interfacial tensions are likely to occur at the boundary between the mantle epithelial cells and the mineralizing shell. The question remains whether colloidal shear forces can be monitored and balanced by the myosin-chitin synthase between the nascent shell and the cytoskeleton of ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Chitin has been suggested to fulfil a functional role in mollusc shell formation. According to current hypotheses, interfacial tensions are likely to occur at the boundary between the mantle epithelial cells and the mineralizing shell. The question remains whether colloidal shear forces can be monitored and balanced by the myosin-chitin synthase between the nascent shell and the cytoskeleton of mantle epithelial cells, while affecting the assembly mode of chitin and indirectly the crystallisation of amorphous calcium carbonate.
It is a matter of current debate how the highly conserved mollusc myosin-chitin synthases should be classified with respect to the families of myosins and glycosyltransferases. The myosin domains of the mollusc chitin synthases are phylogenetically distinct from previously classified myosins. The highly complex transmembrane architecture of mollusc and insect chitin synthases has so far not been observed in fungi. A detailed biochemical characterization of the mollusc myosin-chitin synthases on the example of Ar-CS1 is thus an important prerequisite for understanding the formation of complex chitin-based mineralized structures such as nacre.
Here, the first molecular and biochemical investigations of the myosin domain of Ar-CS1 are presented. Since the low-complexity neck region is likely to perform ionic interactions, the Ar-CS1 myosin domain has been cloned with and without this region. In order to study the function of a putative regulatory site, the Ar-CS1 myosin domain was also modified by site-directed mutagenesis. Dictyostelium discoideum turned out to be an adequate expression system. The compartmentalization of the myosin domain of Ar-CS1 within D. discoideum cells was visualized by using immunofluorescence techniques. All variants of Ar-CS1 myosin domain were located in the cytoplasm. Standard protocols for myosin purifications did not work in the case of Ar-CS1 myosin domain. In general, myosin domains solubilized by extraction from the cytoskeleton are regarded as functional. It turned out that the myosin domain of Ar-CS1 was solubilised only by either urea or pottassium iodide, which are supposed to interfere with hydrophobic interactions. The following purification method for recombinant myosin domains of Ar-CS1 was established: cells lysates were prepared by ultracentrifugation in the absence of detergents. The soluble fraction was dialyzed against a buffer containing KI and subjected to Ni-NTA chromatography. A 90 kDa protein representing the main constituent of the eluate was identified by MALDI as the myosin domain of Ar-CS1. This work provides the basis for the preparative purification of the Ar-CS1 myosin domain, which will allow biochemical and biophysical investigations regarding the regulatory functions and quantification of processivity and force generation of this molecular motor.
The second aim of this work was to establish D. discoideum cell lines for investigating chitin synthesis by Ar-CS1 in vivo, close to the conditions of shell forming mantle epithelial cells. So far, heterologous expression of complex transmembrane proteins such as the Ar-CS1 had previously not been described in the literature. Ar-CS1 with a fluorescent tag was transformed into Ax3 orf+ and in cellulose synthase deficient dcsA- cell lines. First analyses of the Ar-CS1-YFP expressing cell lines showed fluorescence occuring reproducibly in two different variants: in some cell lines distributed accross the cytoplasm, but in others accumulated into globular patterns. Ar-CS1-YFP fluorescence occurred in the cell cortex and in filopodia. Based on these observations, a direct interaction of Ar-CS1-YFP with the cytoskeleton is proposed. At the same time, Ar-CS1-YFP was detected in extracted plasma membrane fractions. The activity was tested by radiochemical detection of chitin polymers in vitro. In addition, weak signals were visualized on the surface of cells cultured in the presence of UDP-GlcNAc, and as well in culture media after filtration by using calcofluor white and GFP-tagged chitin binding proteins. This can be interpreted as the ability of the cell lines, in principle, to synthesize chitin fragments that are mainly delivered into the medium. AFM investigations of the cell surfaces of cell lines expressing Ar-CS1-YFP revealed a granular microstructure not observed in wildtype cells.
Taken together, these experiments indicate that D. discoideum is suitable for the functional expression of Ar-CS1. It remains subject of further investigation how the rate of chitin synthesis is regulated and whether the myosin domain serves for the generation or sensing of forces rather than for spatial processivity as suggested for other unconventional myosins. The new cell lines generated in this thesis provide a powerful model system for enzymatic insights into chitin dependent biomineralization processes.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 09:58
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