Phototropine (Phot-Proteine) fungieren als Photorezeptoren und bestehen aus zwei Flavinmo-nonukleotid (FMN)-bindenden LOV (light, oxygen, voltage)-Domänen und einer Serin/Threonin-Kinasedomäne. Nach Absorption von Licht durchlaufen LOV-Domänen einen Photozyklus, in dem ein kovalentes Photoaddukt aus dem Chromophor FMN und der Aminosäure Cystein 57 gebildet wird. Das Addukt ist metastabil und ...
Abstract (German)
Phototropine (Phot-Proteine) fungieren als Photorezeptoren und bestehen aus zwei Flavinmo-nonukleotid (FMN)-bindenden LOV (light, oxygen, voltage)-Domänen und einer Serin/Threonin-Kinasedomäne. Nach Absorption von Licht durchlaufen LOV-Domänen einen Photozyklus, in dem ein kovalentes Photoaddukt aus dem Chromophor FMN und der Aminosäure Cystein 57 gebildet wird. Das Addukt ist metastabil und kehrt in einer thermischen Reaktion in den Dunkelzustand zurück. Die Reaktionsschritte der Adduktbildung sind noch immer Gegenstand der Diskussion. Neben einem konzertierten bzw. einem ionischen Reaktionsmechanismus wurde ein radikalischer Mechanismus vorgeschlagen. Um diesen Reaktionsmechanismus weiter aufzuklären, untersuchen wir eine Mutante der LOV1-Domäne des Phot-Proteins aus Chlamydomonas reinhardtii, in der Glycin das reaktive Cystein 57 ersetzt (LOV1 C57G). Wir setzen externe Elektronendonoren zu, die die Rolle des reaktiven Cysteins übernehmen sollen. Belichtung von LOV1 C57G in Gegenwart von EDTA, ß-Merkaptoethanol (HOCH2CH2SH), Dimethylsulfid (CH3SCH3), DTT oder internen Elektronen-übertragenden Aminosäuren ergibt eine Spezies, die als neutrales Semiquinon-radikal FMNH° identifiziert wird. Belichtung in Gegenwart von Methylmerkaptan (CH3SH) führt neben dem Radikal zur Bildung einer zusätzlichen Spezies, die aufgrund ihres Absorptionsspektrums als kovalentes Addukt aus FMN und CH3SH interpretiert wird. Die Versuche, das umschließende Protein-Gerüst zu denaturieren, also das Photoaddukt bestehend aus FMN und Methylmerkaptan zu isolieren, scheiterten; das Addukt ist offensichtlich sehr instabil. Aus diesem Grund war es nicht möglich, das Addukt mit Hilfe der Massenspektrometrie zu identifizieren. Allerdings konnte die Struktur das Addukts anhand der CD-Spektroskopie bestätigt werden. Die Belichtung des freien FMN in wässriger Lösung in Gegenwart von Methylmerkaptan ergab nicht das entsprechende freie Addukt aus FMN und Methylmerkaptan, sondern die vollständig reduzierte Hydrochinonform des FMN. Folglich erfüllt das Protein-Gerüst zwei verschiedene Funktionen: Es lenkt die Photoreaktion von FMN und Methylmerkaptan in Richtung Adduktbildung und es stabilisiert das Photoaddukt nach seiner Bildung. Daher konnte diese Studie zeigen, dass aliphatische Merkaptane in einer ähnlichen Weise wie EDTA als Elektronendonoren fungieren. Wenn das Merkaptan aufgrund seiner Größe nicht in der Lage ist, sich dem FMN zu nähern, endet die Reaktion auf der Stufe des neutralen Radikals FMNH° (HOCH2CH2SH). Wenn das Merkaptan klein genug ist, überträgt es ebenfalls ein Elektron und dringt außerdem in die Bindungstasche ein, um eine Bindung zum FMN auszubilden (CH3SH). Auf der Grundlage dieser Experimente nehmen wir an, dass die Adduktbildung in LOV1 C57G über einen radikalischen Zustand als Intermediat verläuft. Folglich favorisieren wir den radikalischen Mechanismus als Reaktionspfad der Photoadduktbildung des wildtypischen Proteins.
Translation of the abstract (English)
Hototropins (phot) act as photoreceptors and consist of two flavin mononucleotide (FMN)-binding LOV (light, oxygen, voltage) domains and a serine/threonine kinase domain. Upon light absorption, LOV domains undergo a photocycle: A covalent photoadduct of the chromophore FMN and cysteine 57 is formed. The adduct is metastable and reverts to the dark form in a thermal reaction. The mechanistic steps ...
Translation of the abstract (English)
Hototropins (phot) act as photoreceptors and consist of two flavin mononucleotide (FMN)-binding LOV (light, oxygen, voltage) domains and a serine/threonine kinase domain. Upon light absorption, LOV domains undergo a photocycle: A covalent photoadduct of the chromophore FMN and cysteine 57 is formed. The adduct is metastable and reverts to the dark form in a thermal reaction. The mechanistic steps of the adduct formation are still under debate. Beside a concerted and an ionic mechanism, respectively, a radical mechanism has been proposed. To further elucidate this reaction mechanism we study a mutant of the LOV1 domain of the phot protein from Chlamydomonas reinhardtii with a glycine replacing the reactive cysteine 57 (LOV1 C57G). We add external electron donors which should take the place of the reactive cysteine. Irradiation of LOV1 C57G in the presence of EDTA, ß-mercaptoethanol (HOCH2CH2SH), methyl sulfide (CH3SCH3), DTT or internal electron donating amino acids yields a species which is identified as neutral semiquinone radical FMNH°. Irradiation in the presence of methyl mercaptan (CH3SH) leads beside the radical to the formation of an additional species which is interpreted as covalent adduct of FMN and CH3SH by its absorption spectrum. Attempts to denature the surrounding protein scaffold, i. e. to isolate the photoadduct consisting of FMN and methyl mercaptan failed. The adduct is apparently very unstable. For this reason, it was impossible to identify the adduct via mass spectrometry. However the structure of the adduct could be confirmed by CD spectroscopy. Irradiation of free FMN in aqueous solution in the presence of methyl mercaptan did not yield the corresponding free adduct of FMN and methyl mercaptan, but the fully reduced hydroquinone form of FMN. Therefore, the protein scaffold carries out two different functions: It guides the photoreaction between FMN and methyl mercaptan to adduct formation and it stabilizes the photoadduct after its formation. Thus, this study could show that aliphatic mercaptans act as electron donors in a similar manner as EDTA. If the mercaptan is not able to approach the FMN due to its size, the reaction stops at the neutral radical FMNH° (HOCH2CH2SH). If the mercaptan is small enough, it transfers an electron as well and in addition, enters the binding pocket to form a bond with FMN (CH3SH). On the basis of these results, we assume that adduct formation in LOV1 C57G proceeds via a radical state as intermediate. Therefore, we favour the radical mechanism as reaction pathway in the photoadduct formation of the wild-type protein.
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