In der medizinischen Forschung gibt es derzeit vielerlei Ansätze, die molekulare Bildgebung sinnvoll in der klinischen Praxis zum Einsatz zu bringen. Variiert werden sowohl die Verfahren der Bilderzeugung als auch die zu detektierenden Zielstrukturen. Die Positronen-Emissions-Tomographie beispielsweise hat den Sprung in die klinische Anwendung geschafft, so wie auch die Kernspinresonanz zunehmend ...
Abstract (German)
In der medizinischen Forschung gibt es derzeit vielerlei Ansätze, die molekulare Bildgebung sinnvoll in der klinischen Praxis zum Einsatz zu bringen. Variiert werden sowohl die Verfahren der Bilderzeugung als auch die zu detektierenden Zielstrukturen. Die Positronen-Emissions-Tomographie beispielsweise hat den Sprung in die klinische Anwendung geschafft, so wie auch die Kernspinresonanz zunehmend nicht nur für morphologische, sondern auch für funktionelle Fragestellungen herangezogen wird. Auch die Bildgebung auf der Grundlage von Fluoreszenz bietet vielversprechende Möglichkeiten, deren Potential für die Krankenhausroutine längst noch nicht ausgeschöpft ist.
Ziel dieser Arbeit war es, die Verteilung fluoreszierender Nanopartikel und Quantenpunkte im Körper am Tiermodell der Ratte nachzuvollziehen. Die Partikel sollten im besten Fall so modifiziert werden, dass sie an Strukturen der Niere binden und so als Marker zur Darstellung der Nierenfunktion herangezogen werden könnten. Hierzu musste zunächst eine Methode zu deren fluorimetrischem Nachweis etabliert werden.
Im ersten Schritt wurden 200 µl der Nanopartikel über einen intravenösen Zugang durch die V. femoralis in den systemischen Kreislauf einer Ratte eingebracht. Nach 30 min bzw. 24 h wurden Nieren, Leber, Lunge, Milz, eine Blut- und eine Urinprobe entnommen. Die Homogenisierung der Organgewebe erfolgte nach einem Schema, das in mehreren Einzelversuchen erarbeitet worden war: In einem Puffer aus PBS und Harnstoff wurde das Gewebe mit dem rotierenden Messer zerkleinert und anschließend mit Triton X-100 vermischt. Nach einer ersten Zentrifugation wurde der Überstand mit SDS inkubiert. In einer anschließenden Dialyse sollte der Harnstoff möglichst vollständig aus den Proben entfernt werden. Eine erneute Zentrifugation entfernte weitere Gewebebestandteile, bevor durch Ultrazentrifugation die Nanopartikel ins Pellet abzentrifugiert und vom Gewebe getrennt werden konnten. Im Fluorimeter gab die Intensität der in Überstand und Pellet gemessenen Fluoreszenzstrahlung schließlich Auskunft über die Verteilung der Partikel im Organismus der Ratte. Die Anreicherung erfolgte in allen Fällen sehr deutlich in der Leber und teilweise auch im Lungengewebe. Dies wurde auf die Phagozytose vor allem durch Kupffer-Sternzellen zurückgeführt. An dieser Tendenz änderten auch unterschiedliche funktionelle chemische Endgruppen nichts, die zu verschiedenen Ladungen der Markermoleküle führten. Bestätigt wurden die fluorimetrischen Ergebnisse durch fluoreszenzmikroskopische Bilder, in denen die Nanopartikel in den Sinusoiden der Leber zur Darstellung kommen.
Auf die verwendeten Quantenpunkte ließ sich das Nachweisverfahren in gleicher Form nicht anwenden, da diese sich als wesentlich störanfälliger erwiesen. Das erste Problem stellte die im Vergleich zu den Nanopartikeln wesentlich kürzere Lebensdauer der Fluoreszenzstrahlung dar, die eine Abgrenzung zur ebenfalls sehr kurzlebigen Hintergrundfluoreszenz erschwerte. Des Weiteren konnte eine erhebliche Unterdrückung des Fluoreszenzsignals durch SDS gezeigt werden, was bei bisheriger Vorgehensweise in der praktischen Durchführung einen Nachweis von Quantenpunkten in Gewebshomogenisat verhindern würde. Als Ausblick für weiterführende Versuche kann auf die Methode des Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) hingewiesen werden, die durch die zeitaufgelöste Messung im Vergleich zur Messung von Einzelwerten einen wesentlich höheren Informationsgehalt bietet. Es könnte somit bei Betrachtung des zeitlichen Verlaufs der Fluoreszenzstrahlung auch eine Differenzierung zwischen markiertem und unmarkiertem Gewebe erreicht werden.
Translation of the abstract (English)
In medical research several approaches, such as various methods of image collection and the identification of suitable targets, are being explored to introduce molecular imaging techniques into clinical practice. Positron emission tomography, for example, is nowadays regularly used in routine clinical settings, and magnetic resonance imaging increasingly not only answers morphological but also ...
Translation of the abstract (English)
In medical research several approaches, such as various methods of image collection and the identification of suitable targets, are being explored to introduce molecular imaging techniques into clinical practice. Positron emission tomography, for example, is nowadays regularly used in routine clinical settings, and magnetic resonance imaging increasingly not only answers morphological but also functional questions. Another method, fluorescence-based imaging, offers a variety of possibilities that are not sufficiently utilized in clinical practice so far.
The aim of the current thesis project was to characterize the distribution of fluorescent nanoparticles and quantum dots in the rat. Ideally particles could be modified in order to label particular structure in the kidneys and thereby serve as markers of renal function. As a first step into this direction a method for the fluorimetric detection of particles had to be established.
Nanoparticles were systemically administered into rats via the femoral vein. Thirty minutes and 24 hours later blood and urine sample were taken and the kidneys, liver, lung and spleen were removed. Homogenization of the tissue samples was done according to a protocol optimized in the course of the thesis project. The tissue was homogenized with a rotating knife in a buffer containing PBS and urea, then Triton X-100 was added and insoluble debris was removed by centrifugation. After the supernatant was incubated with SDS, the solution was dialyzed to remove urea. Again insoluble debris was removed by centrifugation. To collect the nanoparticles, an ultracentrifugation step followed and the fluorescence intensity in the supernatant and pellet was determined. The highest fluorescence intensities were detected in the liver and the lung which can be explained by the high number of macrophages in these organs. Different functional chemical groups decorating the particles resulted in different surface charges of the particles but did not affect their distribution. The results could be confirmed by fluorescence microscopy which demonstrated the presence of nanoparticles in the sinusoids of the liver.
The detection of quantum dots using the same protocol was not successful. For one, their fluorescence declined much faster than that of the nanoparticles which made it difficult to distinguish specific from background fluorescence. Furthermore their fluorescence was considerably quenched by SDS. A possible solution to this problem may be the method of fluorescence lifetime imaging.
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