Die vorliegende Arbeit stellt eine systematische pharmakologische Analyse des bAR dar. Zu diesem Zweck wurden die Eigenschaften verschiedener Liganden an den Fusionsproteinen b1AR-GsaL, b1AR-GsaS, b2AR-GsaL und b2AR-GsaS untersucht (siehe 1.1-1.3). Als Liganden dienten die endogenen Katecholamine Dopamin, Norepinephrin und Epinephrin, sowie die Substanz Isoprenalin (siehe 1.4).
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Abstract (German)
Die vorliegende Arbeit stellt eine systematische pharmakologische Analyse des bAR dar. Zu diesem Zweck wurden die Eigenschaften verschiedener Liganden an den Fusionsproteinen b1AR-GsaL, b1AR-GsaS, b2AR-GsaL und b2AR-GsaS untersucht (siehe 1.1-1.3). Als Liganden dienten die endogenen Katecholamine Dopamin, Norepinephrin und Epinephrin, sowie die Substanz Isoprenalin (siehe 1.4). Mit der Durchführung der [3H]DHA-Kompetitions-Bindung (siehe 3.2), des GTPase-Assays (siehe 3.3) und des AC-Assays (siehe 3.4) wurden drei gut etablierte Methoden zur Untersuchung der Liganden-Rezeptorinteraktion gewählt. Dieses Vorgehen erschien besonders sinnvoll, da die einzelnen Untersuchungs-methoden an unterschiedlichen Punkten im G-Proteinzyklus (siehe 1.3) ansetzen. Dies ermöglichte es, sowohl Aussagen zur Affinität, Effektivität und Potenz der Liganden an den unterschiedlichen Konstrukten zu treffen (siehe 1.4.2 und 3.2-3.4). Die Ergebnisse der maximalen GTPase- und AC-Stimulation zeigten, dass EPI und NE starke partielle Agonisten, DOP jedoch nur ein partieller Agonist war (siehe 3.3, 3.4, 3.5.1 und 4.3.1). Die Effektivität und Potenz der Liganden war nicht nur von den Rezeptoren abhängig, sondern auch von der Splicevariante des Gsa. Der Quotient der Emax-Werte dieser zwei Methoden zeigte teilweise starke Abweichungen vom theoretischen Wert 1 (siehe 4.3.3). Diese Beobachtung unterstützt das Konzept der ligandenspezifischen Rezeptorkonformation. Selbes galt für die Abweichungen des Quotienten der EC50-Werte der GTPase- und AC-Stimulation vom theoretischen Wert 1 (siehe 4.3.4). Die Ergebnisse der [3H]DHA-Kompetitions-Bindung zeigten eine höhere Stabilität des ternären Komplexes am b1AR als am b2AR (siehe 3.2 und 4.3.5). Abweichungen in der Korrelation der maximalen GTPase-Stimulation zur Anzahl der hochaffinen Bindungsstellen ließen sich feststellen (siehe 3.5.2 und 4.3.6), ebenso in der Korrelation der Ki-Werte zur EC50 der GTPase-Stimulation (siehe 3.5.4 und 4.3.7). Abschließend kann festgestellt werden, dass die Ergebnisse dieser Arbeit das Konzept der ligandenspezifischen Rezeptorkonformationen unterstützen (siehe 4.1 und 4.4). Darüber hinaus sollten die Ergebnisse ein Anstoß sein, die Annahme, der menschliche Körper könne nur volle Agonisten produzieren, zu überdenken (siehe 4.3.8).
Translation of the abstract (English)
Fluorescence studies with purified human β2-adrenoceptor (β2AR) revealed that the endogenous catecholamines, (-)-epinephrine (EPI), (-)-norepinephrine (NE), and dopamine (DOP), stabilize distinct active receptor conformations. However, the functional relevance of these ligand-specific conformations is as yet poorly understood. We addressed this question by studying fusion proteins of the ...
Translation of the abstract (English)
Fluorescence studies with purified human β2-adrenoceptor (β2AR) revealed that the endogenous catecholamines, (-)-epinephrine (EPI), (-)-norepinephrine (NE), and dopamine (DOP), stabilize distinct active receptor conformations. However, the functional relevance of these ligand-specific conformations is as yet poorly understood. We addressed this question by studying fusion proteins of the β1-adrenoceptor (β1AR) and β2AR with the short and long splice variants of Gsα (GsαS and GsαL), respectively. Fusion proteins ensure efficient receptor/G-protein coupling and defined stoichiometry of the coupling partners. EPI, NE, DOP, and the prototypical synthetic βAR agonist, (-)-isoproterenol (ISO), showed marked differences in their efficacies at stabilizing the high-affinity ternary complex at β1AR-Gsα and β2AR-Gsα fusion proteins. Ternary complex formation was more sensitive to disruption by GTP with the β2AR than with the β1AR. Generally, in steady-state GTPase assays, ISO, EPI, and NE were full agonists, and DOP was a partial agonist. Exceptionally, at β1AR-GsαL, NE was only a partial agonist. Generally, in adenylyl cyclase assays, ISO, EPI, and NE were full agonists, and DOP was a partial agonist. At β2AR-GsαL, NE was only a partial agonist. There was no correlation between efficacy at stabilizing the ternary complex and activating GTPase, and there were also dissociations between Ki values for high-affinity agonist binding and EC50 values for GTPase activation. In contrast to synthetic partial agonists, DOP did not exhibit increased efficacy at βAR-GsαL versus βAR-GsαS fusion proteins. In conclusion, our data with βAR-Gsα fusion proteins show that endogenous catecholamines and ISO stabilize distinct conformations in the β1AR and β2AR.
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