Molecular and cellular analysis of the "adenylyl cyclase" exotoxins from Bacillus anthracis and Bordetella pertussis

URN to cite this document:: urn:nbn:de:bvb:355-epub-140850
DOI to cite this document:: 10.5283/epub.14085

Spangler, Corinna

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Date of publication of this fulltext: 26 Jul 2010 10:19

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Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Open Access Type:	Primary Publication
Date:	26 July 2010
Referee:	Prof. Dr. Roland Seifert and Prof. Dr. Otto Wolfbeis
Date of exam:	11 June 2010
Institutions:	Chemistry and Pharmacy > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmacology and Toxicology (Prof. Schlossmann, formerly Prof. Seifert)
Interdisciplinary Subject Network:	Not selected
Keywords:	adenylyl cyclases, toxins, edema factor, Bacillus anthracis, Bordetella pertussis, cyclic nucleotides
Dewey Decimal Classification:	500 Science > 570 Life sciences 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	14085

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Abstract (English)

Abstract (English)

The adenylyl cyclase (AC) toxins EF and CyaA contribute to the pathogenity and mortality of anthrax and whooping cough caused by Bacillus anthracis and Bordetella pertussis, respectively. Inhibitors of bacterial toxins would mitigate the course of disease and increase survival rates.
A luminescence-based AC assay was developed as screening tool for AC toxin inhibitors. The assay prooved to be fast and inexpensive and no work-up steps like chromatography are needed. It is performed in 96-well plates, and therefore is suitable for high-throughput screening. The luminescent complex TbNflx responds to changes in analyte concentrations immediately, and hence allows monitoring of real-time enzyme kinetics.
The full characterization of CyaA and EF in vitro and in vivo improves our knowledge of intracellular mechanisms upon infection and leads to a better understanding of disease courses. Thus, substrate-specificity of both toxins was explored in vitro. Cytidylyl cyclase activity was determined to be approximately 300 times lower than AC activity.
Endogenous cCMP and cUMP was identified in HL-60 and J774 cells by a highly specific and sensitive HPLC-MS/MS method. Additionally, we demonstrated the accumulation of cCMP after toxin treatment.
To identify a potential source of endogenous cCMP and cUMP in cells, mammalian ACs were analyzed for cytidylyl and uridylyl activity. Membrane-bound ACs indead produce cCMP in very small amounts, whereas soluble AC produces cCMP as well as cUMP. In microarray and RT-PCR experiments no significant change in mRNA expression upon addition of cCMP and the cell permeable derivative Bt2cCMP could be detected. However, the increase in mRNA expression levels by CyaA could not be explained by the action of cAMP alone.
Therefore, a number of questions remain to be solved: Which effects does cCMP display? Are there target proteins for cCMP? Is there a specific CC or does endogenous cCMP amount from already known mACs? How is the action of cCMP terminated? In conclusion, this work opens a new field of research in an area troubled with artifacts and unconfirmed data.

Translation of the abstract (German)

Die Adenylyl-Zyklase-(AC)-Toxine EF und CyaA tragen zur Pathogenität und Mortalität von Anthrax und Keuchhusten bei. Inhibitoren, die auf bakterielle Toxinen wirken, würden deshalb den Verlauf der Krankheit mildern und die Überlebenschancen erhöhen können.
Ein lumineszenzbasierter AC-Assay wurde für das Screening von Inhibitoren für AC-Toxine entwickelt. Der Assay hat sich als schnell und günstig erwiesen und kann in 96-well Platten durchgeführt werden. Dieser Assay eignet sich daher zur Anwendung im Hochdurchsatz-Screening. Außerdem spricht der lumineszente TbNflx-Komplex sofort auf Änderungen der Analytkonzentrationen an und erlaubt damit die Durchführung von Echtzeitkinetiken dieser Toxine.
Die komplette Charakterisierung von CyaA und EF in vitro und in vivo erweitert unsere Kenntnisse über intrazelluläre Mechanismen bei einer Infektion und führt zu einem besseren Verständnis des Krankheitsverlaufs. Deswegen wurde die Substratspezifität beider Toxine untersucht. Die Cytidylyl-Zyklase-Aktivität beider Toxine liegt ca. um den Faktor 300 niedriger als die AC-Aktivität.
Dabei wurden sowohl cCMP als auch cUMP als endogene Nukleotide in HL-60- und J774-Zellen mit Hilfe einer hochspezifischen und –sensitiven HPLC-MS/MS-Methode identifiziert. Zusätzlich konnten wir die Anreicherung von cCMP nach Toxinbehandlung nachweisen.
Zur Bestimmung einer möglichen Quelle von endogenem cCMP und cUMP in Zellen wurde die Cytidylyl- und Uridylyl -Zyklase-Aktivität von Mammalia-ACs bestimmt. Membrangebundene ACs produzieren sehr kleine Mengen an cCMP, während lösliche AC sowohl cCMP als auch cUMP erzeugt. Die Existenz und Produktion von cCMP und cUMP in lebenden Systemen führte uns zur Frage möglicher biologischer Effekte dieser cNMPs. In Microarray- und RT-PCR Untersuchungen konnte keine signifikante Änderung der mRNA Expression durch Behandlung der Zellen mit cCMP und dem zellpermeablen Derivat Bt2cCMP festgestellt werden. Dennoch kann der Anstieg der mRNA-Expression, der durch CyaA verursacht wird, nicht allein durch die Wirkung von cAMP erklärt werden.
Durch die Ergebnisse dieser Arbeit ergeben sich zahlreiche Fragen: Welche Effecte verursacht cCMP? Gibt es Zielproteine für cCMP? Gibt es eine spezifische CC oder entsteht das endogene cCMP durch die bekannten mACs und sAC? Und nicht zuletzt, wie wird cCMP in der Zelle inaktiviert? Abschließend kann man festhalten, dass diese Arbeit ein neues Forschungsgebiet eröffnet in einem Bereich, der von Artefakten und unbestätigten Daten beherrscht war.

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