| Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen mit Print on Demand (11MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-156839
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.15683
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 4 Mai 2011 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Burkhard König und Prof. Dr. Anja Katrin Bosserhoff |
| Tag der Prüfung: | 26 April 2010 |
| Institutionen: | Chemie und Pharmazie > Institut für Organische Chemie > Lehrstuhl Prof. Dr. Burkhard König |
| Stichwörter / Keywords: | malignant melanoma, MIA, cell migration, protein secretion, formation of metastases, protein dimerization, inhibition of protein dimerization |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 15683 |
Zusammenfassung (Englisch)
Melanoma inhibitory activity (MIA), an 11 kDa protein expressed and secreted by malignant melanoma cells, plays a key role in development and progression of malignant melanoma. It facilitates the release of tumor cells from the primary tumor and thus strongly promotes formation of metastases. However, the processing of MIA protein during cell migration and the characterization of protein activity ...
Zusammenfassung (Englisch)
Melanoma inhibitory activity (MIA), an 11 kDa protein expressed and secreted by malignant melanoma cells, plays a key role in development and progression of malignant melanoma. It facilitates the release of tumor cells from the primary tumor and thus strongly promotes formation of metastases. However, the processing of MIA protein during cell migration and the characterization of protein activity on a molecular level has not been elucidated so far.
These studies detail the mechanism by which MIA protein contributes to the aggressive and invasive behaviour of malignant melanoma cells. After migratory stimuli of tumor cells a directed, microtubule based protein transport to the rear cell pole is induced. MIA protein secretion is a Ca2+-dependent process regulated by the calcium activated potassium channel KCNN4 (IKCa1). This channel type has previously been reported to be in the active state at the rear pole of migrating cells. Following secretion, MIA protein directly interacts with cell adhesion receptors, including integrin alpha4beta1 and alpha5beta1, and extracellular matrix molecules. MIA-integrin-complexes are subsequently internalized into the cell. After dissociation of these complexes, MIA protein is degraded in acidic vesicles while integrins are transported to the cell front to form new adhesion contacts. Since MIA protein secretion is restricted to the cell rear, it mediates localized tumor cell detachment from surrounding structures of the primary tumor and enables invasion into healthy tissues.
At the molecular level, NMR spectroscopy revealed that MIA protein forms homodimers with head to tail linkages. As indicated by mutant analysis in Boyden Chamber invasion assays and further in vitro protein analyses, MIA protein reaches functional activity via self assembly. To inhibit MIA protein function by preventing protein dimerization, MIA binding peptides, which were previously identified in a page display experiment, were specifically screened for their ability to dissociate MIA protein dimers. In order to conduct this screening, a heterogeneous transition-metal based fluorescence polarization assay (HTFP assay) was developed. In this assay format, MIA protein was immobilized in a well plate and MIA protein interactions were detected when the addition of Ru(bpy)3-labeled MIA protein led to an increase in the fluorescence polarization signal. Dodecapeptide AR71 dissociated MIA protein assemblies, as evidenced by a strong decrease in the fluorescence polarization signal. In addition, Western blot analysis also confirmed monomerization of MIA protein after treatment with AR71, while NMR-spectroscopy revealed that AR71 directly binds to the dimerization domain.
By performing Boyden chamber invasion assays functional inhibition of MIA protein by peptide AR71 was also demonstrated in vitro. Therefore, the MIA inhibitory effect of AR71 was analyzed in a murine melanoma mestastases in vivo model. It was clearly demonstrated that treatment with dodecapeptide AR71 strongly reduces the number of metastases in vivo. These studies may constitute a foundation for the development of a MIA protein inhibitor which could represent a new therapeutic strategy as an antimetastatic treatment for malignant melanoma.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Melanoma inhibitory activity (MIA), ein 11 kDa großes Protein, wird von malignen Melanomzellen exprimiert und sekretiert. MIA Protein spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und Progression des malignen Melanoms. Durch direkte Interaktion mit Zelladhäsionsmolekülen und Strukturen der extrazellulären Matrix erleichtert MIA Protein das Ablösen von entarteten Zellen aus dem Primärtumorverband ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Melanoma inhibitory activity (MIA), ein 11 kDa großes Protein, wird von malignen Melanomzellen exprimiert und sekretiert. MIA Protein spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und Progression des malignen Melanoms. Durch direkte Interaktion mit Zelladhäsionsmolekülen und Strukturen der extrazellulären Matrix erleichtert MIA Protein das Ablösen von entarteten Zellen aus dem Primärtumorverband und fördert somit die Metastasenbildung. Der detaillierte Mechanismus des Proteintransportes während der Zellmigration und die Charakterisierung der Proteinaktivität auf molekularer Ebene sind jedoch bis heute noch nicht vollständig aufgeklärt.
Die in dieser Studie erstellten Daten zeigen, auf welchem Mechanismus basierend MIA Protein zum aggressiven Verhalten und invasiven Phänotyp der malignen Melanomzellen beiträgt. Nach migratorischem Stimulus der Tumorzellen wird MIA Protein, eingeschlossen in sekretorischen Vesikeln, entlang von Mikrotubulisträngen gerichtet zum hinteren Zellpol transportiert. Die anschließende Proteinsekretion ist ein Ca2+ abhängiger Prozess, der vom Calzium-aktivierten Kaliumkanal KCNN4 (IKCa1) reguliert wird. In einer bereits veröffentlichten Studie ist beschrieben worden, dass dieser Kanal nur am hinteren Zellpol migrierender Zellen im aktiven Zustand ist. Nach der Sekretion bindet MIA direkt an Zelladhäsionsrezeptoren wie Integrin alpha4beta1 und alpha5beta1, und an extrazelluläre Matrixstrukturen. MIA-Integrin-Komplexe werden sofort nach ihrer Bildung internalisiert. Nach ihrer Aufnahme dissoziieren die Komplexe, MIA Protein wird in Lysosomen abgebaut während Integrine wieder zur Zellfront transportiert werden um dort neue Zelladhäsionskontakte bilden zu können. Da sich die MIA Proteinsekretion in migrierenden Zellen auf den hinteren Zellpol beschränkt, unterstützt MIA fokales Ablösen der Tumorzelle von umgebenden Strukturen und ermöglicht so eine gerichtete Invasion in umliegendes gesundes Gewebe.
Molekulare Protein Analysen mittels NMR-Spektroskopie zeigen, dass MIA ein Homodimer mit sogenanntem „head to tail“ Bindungsmotiv bildet. In Western Blot Analysen und in vitro Invasions Experimenten mit MIA Mutanten wurde gezeigt, dass MIA Protein durch Dimerisierung funktionelle Aktivität erlangt. Um MIA Protein funktionell zu hemmen, wurde gezielt nach MIA Protein bindenden Peptiden gescreent, die in der Lage sind Dimerisierung zu verhindern bzw. bereits bestehende Dimere aufzubrechen und damit das Protein zu inaktivieren.
Zur Durchführung eines solchen Screening Experiments wurde ein heterogener Übergangsmetall-basierter Fluoreszenz Polarisations Assay (HTFP assay) entwickelt. Für diese Untersuchungsmethode wird biotinyliertes MIA Protein in einer Streptavidin beschichteten Wellplate immobilisiert. Nach Zugabe von Ru(bpy)3 markiertem MIA Protein kommt es zur Protein-Protein Interaktion und damit auch zum Anstiegs des Fluoreszenzpolarisationssignals. Das Dodekapeptid AR71 dissoziiert MIA-MIA Bindungen und führt zu einer starken Abnahme des Fluoreszenzpolarisationssignals. Auch in Western Blot Analysen bestätigt sich, dass MIA Dimere nach Behandling mit Peptid AR71 aufgebrochen werden. Die Binding-Site dieses Peptids wurde mittels NMR-Spektroskopie identifiziert. Sie befindet sich genau in der Dimerisierungsdomäne des MIA Proteins. Da Peptid AR71 MIA Protein Aktivität in vitro hemmt, wurde der inhibitorische Effekt des Peptids auch in vivo in einem murinen Melanom Metastasen Modell analysiert. Die Behandlung der Tiere mit Dodekapeptid AR71 führt zu einer stark reduzierten Anzahl der Metastasen. Diese Studien bestätigen, dass MIA Protein ein neues Target Molekül für die Behandlung des malignen Melanoms darstellt. Ein MIA Protein Inhibitor könnte einen neuen, antimetastatischen Therapieansatz liefern.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 08:51
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