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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-157367
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.15736
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Seitenanzahl: | 200 |
| Datum: | 4 August 2010 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Wolfgang Bäumler und Prof. Dr. Alfons Penzkofer |
| Tag der Prüfung: | 27 Mai 2010 |
| Institutionen: | Nicht ausgewählt |
| Themenverbund: | Nicht ausgewählt |
| Stichwörter / Keywords: | Singulett-Sauerstoff, UVA, Bakterien, Zellen, Proteine, Fettsäuren, Lumineszenz, Sauerstoffverbrauch sinlet oxygen, UVA, bacteria, cells, proteins, fatty acids, luminescence, oxygen consumption |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 530 Physik |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 15736 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Die photodynamische Therapie (PDT), wie sie seit über 100 Jahren angewandt wird, basiert auf der Wechselwirkung von Licht, Farbstoff und Sauerstoff. Die Wirkung der PDT beruht auf der Zerstörung von Zellen durch Oxidation, hauptsächlich durch Singulett-Sauerstoff. Die PDT wird zur Behandlung maligner und prämaligner Gewebeveränderungen eingesetzt. Ein neuer Bereich für die Anwendung ist die ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Die photodynamische Therapie (PDT), wie sie seit über 100 Jahren angewandt wird, basiert auf der Wechselwirkung von Licht, Farbstoff und Sauerstoff. Die Wirkung der PDT beruht auf der Zerstörung von Zellen durch Oxidation, hauptsächlich durch Singulett-Sauerstoff. Die PDT wird zur Behandlung maligner und prämaligner Gewebeveränderungen eingesetzt. Ein neuer Bereich für die Anwendung ist die antimikrobielle photodynamische Therapie (aPDT), bei der Mikroorganismen, wie Bakterien oder Pilze, auf die gleiche Weise wie bei der PDT, abgetötet werden sollen. Dafür ist allerdings zuerst ein besseres Verständnis der Interaktionen von Singulett-Sauerstoff, den verwendeten Farbstoffen und den Mikroorganismen notwendig. Des weiteren ist für die Anwendung von Photosensibilisatoren in der aPDT eine wichtige Voraussetzung, dass die Inkubationszeit der Farbstoffe kürzer ist, als die Zeit, die die Zellen und Bakterien benötigen, um sich zu teilen. Außerdem muss ein therapeutisches Fenster gefunden werden, also Bedingungen, bei denen die Bakterien bereits sterben, die Körperzellen jedoch noch überleben.
Aus all diesen Gründen müssen die Bedingungen am Ort der Wechselwirkung zwischen Singulett-Sauerstoff und den Mikroorganismen näher betrachtet werden.
Dazu wurden die bereits bekannten theoretischen Modelle für die Generierung und Relaxation von Singulett-Sauerstoff verwendet, wobei die Sauerstoffabhängigkeit der verschiedenen Prozesse besonders betrachtet wurde. Zusätzlich wurde auf oxidative Prozesse an zelleigenen Materialien und die Diffusion von Sauerstoff eingegangen.
Zentrale Aufgabe im Rahmen der vorliegenden Arbeit war der direkte Nachweis von Singulett-Sauerstoff mittels zeitlich und spektral aufgelöster Detektion seiner Lumineszenz im Infrarot-Bereich. Auf Grund der extrem schwachen Lumineszenz von Singulett-Sauerstoff kam ein hochempfindlicher Infrarot-Photomultiplier zum Einsatz, der in Kombination mit einer schnellen Zähleinrichtung eine Zeitauflösung von etwa 100 ns ermöglichte. Durch weitere Verbesserungen im Bereich der verwendeten Interferenzfilter und der Sauerstoff-Detektion durch einen externen Sensor, konnte das Verhalten von Singulett-Sauerstoff in komplexer werdenden Umgebungen betrachtet werden.
In einfachen Farbstoff-Lösungsmittel-Gemischen wurden die Farbstoffe XF73 in Wasser und Perinaphthenon in Ethanol, als mögliche Photosensibilisatoren für die aPDT, untersucht. Dabei diente TMPyP sowohl in Wasser, als auch in Ethanol als Referenzfarbstoff. Durch die Variation der Sauerstoff-, Farbstoff- und Quencher-Konzentration konnten die relevanten Raten und Ratenkonstanten für die Generierung und Relaxation von Singulett-Sauerstoff in einfachen Lösungen bestimmt werden. Es zeigt sich, dass die Singulett-Sauerstoff-Abklingdauer im wesentlichen vom Lösungsmittel und der Quencher-Konzentration abhängt. Wohingegen sich die Farbstoff-Triplett-Abklingdauer hauptsächlich nach der Sauerstoff-Konzentration am Ort des angeregten Farbstoffs richtet.
Um sich den Verhältnissen in Zellen anzunähern, wurden zunächst die Erzeugung und Deaktivierung von Singulett-Sauerstoff in Lösungen untersucht, die Fettsäuren oder Proteine enthielten. Dabei zeigte sich, dass durch die Oxidation der Biomoleküle die Lumineszenzsignale sich bereits innerhalb der Detektionsintervalle ändern können, so dass eine Anpassung der Parameter (kürzere Messdauern, Einsatz eines Magnetrührers) notwendig wurde, um die Raten und Ratenkonstanten von Singulett-Sauerstoff unter definierten Bedingungen zu bestimmen. Die Proteine und die ungesättigten Fettsäuren waren in der Lage Singulett-Sauerstoff physikalisch und chemisch zu quenchen, wobei der Sauerstoffverbrauch durch das chemische Quenchen beobachtet werden konnte. Dieser wurde in Abhängigkeit von der Molekülgröße bei Proteinen, bzw. der Anzahl der Doppelbindungen bei Fettsäuren bestimmt. Dabei zeigte sich, dass je kleiner die Proteine, bei gleichbleibender Gesamtmasse, oder je ungesättigter die Fettsäuren waren, desto mehr Sauerstoff verbraucht wurde. Der Einfluß des Sauerstoffverbrauchs zeigte sich am deutlichsten bei der Bestimmung der Farbstoff-Triplett-Abklingdauer, die sehr empfindlich auf die Abnahme der Sauerstoff-Konzentration reagierte und eine Abschätzung der Sauerstoff-Konzentration am Ort der Laseranregung zu ließ, da diese nicht durch den Sauerstoffsensor bestimmbar war. Auch konnte der quenchende Einfluß der Proteine und der ungesättigten Fettsäuren auf die Singulett-Sauerstoff-Abklingdauer abgeschätzt werden.
Im Rahmen der Untersuchungen zu Fettsäuren hat sich ergeben, dass Singulett-Sauerstoff durch Anregung mit UVA-Strahlung auch ohne einem Photosensibilisator erzeugt werden kann. Dabei wurde festgestellt, dass nur die mehrfach ungesättigten In der Lage waren über einen längeren Zeitraum Singulett-Sauerstoff in messbaren Mengen zu generieren. Entscheidend dabei war die Menge der oxidierten Fettsäuren, die, wie am Beispiel der Arachidonsäure durch HPLC-Analysen gezeigt, mit der Menge an erzeugtem Singulett-Sauerstoff korreliert. Durch den Russel-Mechanismus wurde auch noch eine möglicher Weg zur Erzeugung von Singulett-Sauerstoff aus den nachgewiesenen Lipidhydroperoxiden vorgestellt.
Erstmals war es möglich die Lumineszenzsignale von Photosensibilisatoren aus Zellen und Bakterien unter verschiedenen Bedingungen (O2-Konzentration, Zelltyp) zu detektieren und auszuwerten. Dabei zeigte sich, dass der Sauerstoffverbrauch bei den Gram-positiven S. aureus-Bakterien unabhängig vom verwendeten Farbstoff ist, bei den Gram-negativen E. coli jedoch im Vergleich zu TMPyP ein stärkerer Verbrauch bei XF73 festgestellt werden konnte.
Aus den Lumineszenzsignalen konnten die Anstiegs- und Abklingzeiten eindeutig der Farbstoff-T1-Abklingdauer und der Singulett-Sauerstoff-Abklingdauer zugeordnet werden.
Durch die ermittelten Farbstoff-T1-Abklingzeiten bei Zellen und Bakterien konnten die Sauerstoff-Konzentrationen in der Umgebung der verwendeten Farbstoffe abgeschätzt werden und somit, ebenso wie aus den Singulett-Sauerstoff-Abklingzeiten, die Veränderungen in der Lokalisation der Farbstoffe, wie sie in den Fluoreszenzbildern beobachtet wurden, zumindest bei den Zellen bestätigt werden. Bei den XF73-inkubierten Bakterien lag die Sauerstoff-Konzentration und die Singulett-Sauerstoff-Abklingdauer bei niedrigeren Werten als bei TMPyP-inkubierten. Diese Beobachtungen lassen sich mit einer besseren Aufnahme des neuen Farbstoffs XF73 gegenüber dem Referenzfarbstoffs TMPyP erklären. Auch konnte bei den Gram-positiven S. aureus-Bakterien ein höherer Sauerstoffverbrauch als bei E. coli-Bakterien beobachtet werden, so dass von einer besseren Wirksamkeit der Farbstoffe bei Gram-positiven als bei Gram-negativen Bakterien ausgegangen werden kann.
Durch die somit erhaltenen Ergebnisse wurden aber auch neue Fragen aufgeworfen. So muss für weiterführende Messungen die Lokalisation der Farbstoffe in Bakterien durch chemische Analysen bestimmt werden, ebenso wie die Abhängigkeit der Lumineszenz und der Zelltoxizität von der Menge des aufgenommenen Farbstoffs. Dazu kann gegebenenfalls auch die Entwicklung neuer Farbstoffe notwendig sein, die besser von Zellen oder Bakterien aufgenommen werden.
In dieser Arbeit konnte erstmals die Generierung von Singulett-Sauerstoff durch Fettsäuren ohne Sensibilisator unter UVA-Bestrahlung festgestellt werden, jedoch sind noch weitere Experimente mit effektiven Quenchern notwendig, um den Mechanismus der Singulett-Sauerstoff-Generierung vollständig zu klären. Für weitere Untersuchungen von endogenen Photosensibilisatoren, wie Fettsäuren oder Proteinen, bieten sich Untersuchungen im nahen UVB-Bereich an, da dort die Moleküle höhere Absorptionswirkungsquerschnitte besitzen, wodurch wegen der verstärkten Absorption bessere Signale erzeugt werden können. Auch können somit weitere körpereigene Moleküle, wie Urocaninsäure oder L-alpha-Phosphatidylcholin, auf Singulett-Sauerstoff-Generierung getestet werden.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
The principle mechanism of action in photodynamic therapy (PDT) is the interaction of light, dye and oxygen that predominantly generates the highly reactive singlet oxygen. In case the dye molecules (photosensitizer) are taken up and located inside cells, the generated singlet oxygen destroys the cells (e.g. tumor cells) by oxidation of cellular constituents such as lipids and proteins. A novel ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
The principle mechanism of action in photodynamic therapy (PDT) is the interaction of light, dye and oxygen that predominantly generates the highly reactive singlet oxygen. In case the dye molecules (photosensitizer) are taken up and located inside cells, the generated singlet oxygen destroys the cells (e.g. tumor cells) by oxidation of cellular constituents such as lipids and proteins.
A novel application of this photodynamic principle is the killing of microorganism like bacteria or fungi (antimicrobial photodynamic therapy, aPDT). To evaluate and hence optimize aPDT, investigation of generation and decay of singlet oxygen in these microorganisms is necessary. The present work focuses on the use of aPDT in bacteria, in particular the multi-resistant species. A major prerequisite of safe and effective aPDT in clinical applications is the incubation of bacteria with a photosensitizer that kills the bacteria but spares the surrounding normal cells of the tissue. This requires the optimization of concentration and localization of photosensitizer in bacteria and cells. After different incubation times and applied photosensitizer concentrations, irradiation of cells and bacteria generates singlet oxygen close to the localization of the photosensitizer. This process can be detected and investigated by time- and spectral resolved luminescence detection of singlet oxygen. The results should allow a better understanding of intracellular singlet oxygen activity and hence enable optimization of aPDT.
The well known theoretical model for generation and decay of singlet oxygen was used. In particular, the dependence of singlet oxygen generation and decay on the oxygen concentration was considered since the interaction of singlet oxygen with cellular constituents consumes oxygen. Additionally oxidative processes of cellular ingredients and the diffusion of oxygen were investigated.
The direct proof of singlet oxygen by time and spectral resolved detection of its luminescence, even in living cells and bacteria, was the main topic of this dissertation. Due to the extremely small quantum yield of singlet oxygen luminescence, a very sensitive infrared photomultiplier was used along with a fast single photon counting system. The dyes XF73 and PN were investigated as possible photosensitizers for aPDT, whereas the porphyrine TMPyP acted as reference dye.
First, all important rate and rate constants for the generation and decay of singlet oxygen in solution (water and ethanol) were determined for these photosensitizers. Thereby, the concentrations of oxygen, dye or quencher substances were varied. It was clearly shown that singlet oxygen decay rate depends on the quencher concentration and the solvent, whereas decay rate of the photosensitizer triplet T1 state rather depends on the oxygen concentration.
After that, the generation and decay of singlet oxygen in solutions with fatty acids and proteins were investigated. This is a first and simple model to proof the conditions for singlet oxygen in cells or bacteria. The results showed that the luminescence signals changed due to peroxidation of biomolecules and subsequent oxygen consumption, even during the short time span of luminescence detection. This effect was considered in the consecutive experiments. The proteins and the fatty acids were able to quench singlet oxygen physically and chemically, which depended on the size of the proteins or on the number of double bounds in the fatty acids. The influence of the oxygen consumption on the luminescence signals was clearly observed when analyzing the triplet T1 decay rate of the photosensitizer. This in turn can be used to estimate the oxygen concentration at the site of singlet oxygen generation.
It was a surprising result that singlet oxygen could be generated by exciting fatty acids at 355 nm without the addition of a photosensitizer. The amount of singlet oxygen depended on the number of double bounds of the fatty acids and the amount of already oxidized fatty acids, as shown by HPLC-analysis of arachidonic acid. Possible mechanisms of this singlet oxygen generation were suggested to be chemical reactions such as charge transfer or the Russel-mechanism.
In the next and important step it was possible to detect and to quantify the luminescence of singlet oxygen in cells and bacteria under different conditions (oxygen concentration, cell/bacteria type). The results showed oxygen consumption, which depended on the photosensitizer and bacteria used. Oxygen consumption in gram positive bacteria S. aureus (with XF73) was higher as compared to gram negative E. coli incubated with TMPyP. The luminescence signals were sufficient to allow a clear assignment of the rise and decay rates to singlet oxygen decay rate and triplet T1 decay rate.
The oxygen concentration at the subcellular localization of the photosensitizers in cells (HT-29 cells) could be estimated by evaluating the decay rates of triplet T1 and singlet oxygen decay. These results were additionally compared to fluorescence microscopic images that showed the subcellular localization of the respective photosensitizers in the cells. The observations can be explained by better uptake of XF73 in cells in comparison to TMPyP.
In conclusion, the work demonstrates that singlet oxygen can be detected in living cells and bacteria after incubation with different photosensitizers using different incubation times and concentrations. By analyzing the luminescence rise and decay rates, correlations with other parameters such as oxygen consumption and subcellular localization of photosensitizer were possible. The results assist the understanding and optimization of aPDT, in particular when testing and using novel dye molecules as photosensitizers.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 08:47
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