| License: Publishing license for publications excluding print on demand (4MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-157379
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.15737
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 5 August 2011 |
| Referee: | Prof. Dr. Ernst Tamm and Prof. Dr. Anja Bosserhoff and Prof. Dr. Stephan Schneuwly |
| Date of exam: | 6 July 2010 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Anatomie > Lehrstuhl für Humananatomie und Embryologie > Prof. Dr. Ernst Tamm |
| Keywords: | CTGF, connective tissue growth factor, Glaukom, extrazelluläre Matrix, Aktin, Zytoskelett, intraokulärer Druck |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 15737 |
Abstract (German)
Der Connective Tissue Growth Factor (CTGF) ist ein sezerniertes Glykoprotein aus der Familie der CCN-Proteine. CTGF ist aufgrund seiner Multidomänenstruktur in der Lage an verschiedenste Transmembran-, extrazelluläre Matrix (EZM)- sowie Signalproteine zu binden und deren Funktion zu beeinflussen. So stimuliert oder vermittelt CTGF die Adhäsion, Migration und Proliferation von Zellen und ist als ...
Abstract (German)
Der Connective Tissue Growth Factor (CTGF) ist ein sezerniertes Glykoprotein aus der Familie der CCN-Proteine. CTGF ist aufgrund seiner Multidomänenstruktur in der Lage an verschiedenste Transmembran-, extrazelluläre Matrix (EZM)- sowie Signalproteine zu binden und deren Funktion zu beeinflussen. So stimuliert oder vermittelt CTGF die Adhäsion, Migration und Proliferation von Zellen und ist als Wachstumsfaktor essentiell für die Entwicklung bestimmter Gewebe. Besondere Beachtung findet CTGF allerdings im Zusammenhang mit der Pathogenese fibrotischer Erkrankungen. In diesen Fällen wird CTGF oftmals als Downstream-Mediator des pro-fibrotischen Faktors Transforming Growth Factor (TGF)-β gehandelt. TGF-β2 wird mit der Pathogenese des primären Offenwinkelgalukoms (POWG) in Zusammenhang gebracht, was auch eine Rolle von CTGF bei der Pathogenese dieser Krankheit nahelegt.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es die Funktionen von CTGF im Trabekelwerk des Auges zu charakterisieren. Dazu sollten zunächst Signalmoleküle identifiziert werden, die CTGF im Trabekelwerk induzieren. Anschließend sollte CTGF in einem eukaryotischen System rekombinant hergestellt und aufgereinigt werden, um über in vitro Versuche den Einfluss von CTGF auf humane Trabekelwerkzellen zu analysieren. Diese Ergebnisse sollten in vivo über die Entwicklung von transgenen Mäusen mit einer CTGF-Überexpression überprüft werden. Um die physiologische Funktion von CTGF in humanen Trabekelwerkzellen zu untersuchen, sollte ein stabiler Knockdown von CTGF durchgeführt werden.
Neben TGF-β waren die im KW vorhandenen Faktoren Endothelin-1, Angiotensin II und IGF-1 in der Lage die Expression von CTGF in humanen TWZ zu erhöhen. Rekombinantes CTGF konnte nach Anfügen eines His-Tags an den C-Terminus durch Ausnutzung seiner Affinität zu Heparin sowie zu Ni2+-NTA aufgereinigt werden. Die biologische Funktionalität konnte nach Behandlung von TWZ bestätigt werden. CTGF induzierte die Expressionen wichtiger EZM-Proteine wie FN und mehrerer Kollagene, sowie die der Integrin-Untereinheiten αV und β1. und vermittelte die Effekte von TGF-β auf die Expression dieser Proteine. Die Effekte von TGF-β auf das extrazelluläre proteolytische Systeme zeigten sich nicht durch CTGF vermittelt. Neben den Veränderungen an EZM und Integrinen konnten auch Effekte auf das Aktinzytoskelett beobachtet werden. CTGF erhöhte zum einen die Expression bedeutender Komponenten wie etwa α-smAktin. Zum anderen führte die Behandlung zur Beeinflussung von intrazellulären Signalmolekülen, die für die Regulation des Aktinzytoskeletts verantwortlich sind. CTGF konnte die Aktivität der kleinen GTPase RhoA, der Myosin Light Chain, der Focal Adhesion Kinase sowie der Extracellular Signal Regulated Kinase erhöhen. Dies führte unter anderem zu einer Zunahme an Aktin-Stressfasern in den Zellen und zu einer erhöhten Kontraktilität. In einem in vivo-Mausmodell mit einer Augen-spezifischen CTGF-Überexpression konnte ebenso eine Vermehrung von FN und α-smAktin im TW nachgewiesen werden. Zudem wiesen die transgenen Mäuse einen Anstieg des IOD auf.
Ein stabiler Knockdown von CTGF konnte in immortalisierten TWZ mit Hilfe eines pSilencer-Vektors erreicht werden. Dies führte zu einer verminderten Expression einiger Effektorproteine von CTGF und zu einer reduzierten oder vollständig blockierten Aktivität derjenigen Signalmoleküle, die in Wildtypzellen durch CTGF aktiviert wurden. In zellphysiologischen Untersuchungen konnte weiterhin eine reduzierte migratorische und proliferative Aktivität aufgezeigt werden. Die Adhäsion an Oberflächen hingegen wurde durch den CTGF-Knockdown verstärkt. Eine Behandlung mit rekombinantem CTGF konnte im Falle der Proliferation sowie der Adhäsion eine Angleichung an den Wildtyp herstellen, führte aber zu einem weiteren Absinken der Expression von CTGF Effektorproteinen.
Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass CTGF nicht nur in der Lage ist, die EZM sondern auch die Kontraktilität des TW zu beeinflussen. Diese Veränderungen können zu einem Anstieg des intraokulären Drucks und damit zu einem erhöhten Risiko für die Erkrankung des POWG führen. Somit kann CTGF als ein kritischer Faktor in der Pathogenese des POWG angesehen werden.
Translation of the abstract (English)
Connective Tissue Growth Factor (CTGF) is a secreted glycoprotein and a member of the CCN (Cyr61, CTGF, Nov) family. Because of its multi domain structure, CTGF is able to bind to various transmembrane, extracellular matrix (ECM) and signaling proteins and to modulate their functions. The role of CTGF in the regulation of cell adhesion, migration and proliferation has been examined for CTGF. In ...
Translation of the abstract (English)
Connective Tissue Growth Factor (CTGF) is a secreted glycoprotein and a member of the CCN (Cyr61, CTGF, Nov) family. Because of its multi domain structure, CTGF is able to bind to various transmembrane, extracellular matrix (ECM) and signaling proteins and to modulate their functions. The role of CTGF in the regulation of cell adhesion, migration and proliferation has been examined for CTGF. In particular, the involvement of CTGF in the pathogenesis of fibrotic diseases has been described. In these cases, CTGF is often expected to be a downstream mediator of the profibrotic factor Transforming Growth Factor (TGF)-β. It has been postulated that TGF-β2 is involved in the pathogenesis of primary open angle glaucoma. This suggests that CTGF might also have a role in the pathogenesis of this disease.
The object of this thesis was to characterize the functions of CTGF in the trabecular meshwork of the eye. We first examined potential activators of CTGF expression in the trabecular meshwork. Afterward recombinant CTGF had to be produced to analyze the influence of CTGF on human trabecular meshwork cells in vitro. These results then had to be confirmed by analyzing mice with a specific overexpression of CTGF in the lens of the eye. To observe the physiologic functions of CTGF in trabecular meshwork cells with a stable knockdown of CTGF expression had to be established and analyzed.
In addition to TGF-β, the factors Endothelin-1, Angiotensin II and IGF-1 were able to increase the expression of CTGF in trabecular meshwork cells. Recombinant CTGF was purified and showed biological activity in the form of increased expression and deposition of basic ECM proteins such as fibronectin and several collagen types as well as expression of the Integrin subunits αV and β1. Further, CTGF was able to mediate the effects of TGF-β on the expression of these proteins. Effects of TGF-β on the extracellular proteolytic system were not mediated by CTGF.
Along with changes in the ECM, effects on the organization of the actin cytoskeleton could also be observed. CTGF treatment led to an elevation in the expression of important components such as α-smooth muscle actin. Furthermore, the CTGF treatment had a significant influence on the activity of signaling molecules responsible for the regulation of actomyosin dynamics. CTGF was able to elevate the activity of RhoA GTPase, the myosin light chain, and the focal adhesion and Extracellular signal regulated Kkinases. This led to an increase of actin stress fibers and to a higher contractility of trabecular meshwork cells. In an in vivo mouse model with an eye specific overexpression of CTGF we could also detect a higher expression of fibronectin and α-smooth muscle actin. In addition, the transgenic mice showed a significant increase of intraocular pressure.
A stable knockdown of CTGF led to a reduced expression of fibronectin and α-smooth muscle actin and to a reduced or completely blocked activity of the signaling molecules mentioned above. In cell based assays we observed reduced migratory and proliferatory activity. In contrast, the ability to attach to surfaces was increased. Treatment with recombinant CTGF led to a rescue of the phenotype in case of proliferation and adhesion, but led also to a further decrease in the expression of CTGF effector proteins.
All together we could show, that CTGF is not only able to influence the ECM but also the actomyosin contractility. These changes can lead to an increase of intraocular pressure and therefore to an increased risk for primary open angle glaucoma. Thus CTGF could be considered as a possible causative factor in the pathogenesis of primary open angle glaucoma.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 08:47
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