Modulation of conformational equilibria of human H-Ras protein by metal-chelate derivatives and high pressure studied by NMR spectroscopy

Dokumentenart:	Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation)
Open Access Art:	Primärpublikation
Datum:	5 Juli 2011
Begutachter (Erstgutachter):	Prof. Dr. Dr. Hans Robert Kalbitzer
Tag der Prüfung:	11 Juni 2010
Institutionen:	Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Dr. Hans Robert Kalbitzer
Themenverbund:	Nicht ausgewählt
Stichwörter / Keywords:	Ras, NMR, cyclen, conformational dynamics
Dewey-Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Status:	Veröffentlicht
Begutachtet:	Ja, diese Version wurde begutachtet
An der Universität Regensburg entstanden:	Ja
Dokumenten-ID:	15768

Zusammenfassung (Englisch)

The small guanine nucleotide binding protein Ras is essentially involved in the regulation of cell proliferation, differentiation and apoptosis. Alternating between an inactive GDP and an active GTP-bound form, Ras acts as molecular switch. Only active Ras can bind different effectors and transduce the signal. In about 30% of all human tumors Ras is locked in the active GTP-bound form, which ...

Zusammenfassung (Englisch)

The small guanine nucleotide binding protein Ras is essentially involved in the regulation of cell proliferation, differentiation and apoptosis. Alternating between an inactive GDP and an active GTP-bound form, Ras acts as molecular switch. Only active Ras can bind different effectors and transduce the signal. In about 30% of all human tumors Ras is locked in the active GTP-bound form, which contributes to tumor formation. 31P NMR spectroscopy using the bound nucleotide as probe reveals the dynamic equilibrium between at least two distinct conformational substates in active Ras. State (2) becomes stabilized by binding of effectors, while state (1) shows a drastically reduced affinity towards effectors. Chaotropic compounds, high pressure and metal(II)-cyclens shift the dynamic equilibrium towards conformational state (1). The directed stabilization of state (1) by suitable ligands represents a promising approach for the inhibition of aberrant Ras signaling.
Within this work a second compound class also capable of stabilizing state (1) was identified by primary NMR screening. It could be shown by suitable 2D NMR spectroscopic investigations that both compounds achieve their stabilizing effect by binding at different sites of the protein. Hence, both compounds represent different lead structures for the development of inhibitors for oncogenic Ras.
The influence of high pressure, which favours Ras in conformational state (1) was investigated at atomic resolution by [1H, 15N]-HSQC spectroscopy. Residues involved in the transition between conformational state (1) and (2), respectively could be identified. The complex signalling network of Ras requires the simultaneous presence of multiple functional states allowing Ras the fast transition into a certain conformation. The high pressure NMR data reveal the coexistence between at least four different conformational states in active Ras.

Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)

Das kleine Guaninnukleotid-bindende Protein Ras ist essentiell an der Regulierung der Proliferation, Differenzierung und Apoptose von Zellen beteiligt. Es fungiert als molekularer Schalter indem es zwischen einer inkativen Form, gebunden an GDP und einer aktiven Form, gebunden an GTP wechselt. Nur aktives Ras kann verschiedene Effektoren binden und somit Signale weiterleiten. In circa 30% aller ...

Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)

Das kleine Guaninnukleotid-bindende Protein Ras ist essentiell an der Regulierung der Proliferation, Differenzierung und Apoptose von Zellen beteiligt. Es fungiert als molekularer Schalter indem es zwischen einer inkativen Form, gebunden an GDP und einer aktiven Form, gebunden an GTP wechselt. Nur aktives Ras kann verschiedene Effektoren binden und somit Signale weiterleiten. In circa 30% aller menschlichen Tumoren verbleibt Ras in seiner aktiven Form und trägt somit zur Tumorentstehung bei. 31P NMR Spektroskopie mit dem gebunden Nukleotid als Probe zeigt das Vorliegen eines dynamischen Gleichgewichts zwischen mindestens zwei konformationellen Zuständen in aktivem Ras. Zustand (2) wird durch die Bindung an Effektoren stabilisiert, während Zustand (1) eine drastisch reduzierte Affinität für Effektorproteine aufweist. Chaotrope Subtanzen, hoher Druck und Metall(II)-Zyklene verschieben dieses Gleichgewicht zugunsten des Zustands (1). Die gezielte Stabilisierung von Zustand (1) durch geeignete Liganden stellt einen viel versprechenden Ansatz für die Hemmung der abnormen Signalweiterleitung von onkogenem Ras dar.
In dieser Arbeit wurde mittels primärem NMR Screening eine zweite Subtanzklasse indentifiziert, die ebenfalls die Eigenschaft besitzt, selektiv Zustand (1) zu stabilisieren. Geeignete 2D NMR spektroskopische Experimente zeigen, dass beide Subtanzklassen ihren stabilisierenden Effekt durch die Bindung an verschiedenen Stellen im Protein erreichen. Beide Subtanzen dienen also als unterschiedliche Leitstrukturen für die Entwicklung von Inhibitoren für onkogenes Ras.
Der Einfluss von hohem Druck, der Ras in Konformation (1) bevorzugt wurde mit atomarer Auflösung mittels [1H, 15N]-HSQC Spektroskopie untersucht. Dabei konnten Reste, die am Übergang von Zustand (2) zu Zustand (1) beteiligt sind identifiziert werden. Das komplexe Signalnetzwerk von Ras verlangt das gleichzeitige Vorliegen mehrere Zustände, wodurch es dem Protein erlaubt wird schnell eine bestimmte Konformation einzunehmen. Die Hochdruckdaten zeigen die Koexistenz von mindestens vier unterschiedlichen Konformationen in aktivem Ras.

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